体外转录法siRNA合成后，为何必须进行DNase和磷酸酶处理？这些步骤如何影响siRNA的活性？

    在体外转录法合成siRNA的流程中，DNase（脱氧核糖核酸酶）和磷酸酶处理是确保siRNA纯度、活性及实验可靠性的关键质控步骤，其核心目的是去除合成体系中残留的“杂质分子”——这些杂质会直接干扰siRNA的RNA干扰（RNAi）功能，甚至引发非特异性细胞反应。以下从“处理的必要性”“对siRNA活性的具体影响”两方面展开详细说明：

一、为何必须进行DNase处理？——去除残留的DNA模板

    体外转录法合成siRNA的核心原理是：以双链DNA（dsDNA）为模板（通常是含siRNA正义链和反义链编码序列的DNA片段，或含T7/SP6等启动子的质粒），通过RNA聚合酶（如T7聚合酶）转录生成siRNA的正义链和反义链，再通过退火形成双链siRNA（dssiRNA）。这一过程中，DNA模板不会被消耗完全，必然残留于最终产物中，因此需要DNase处理去除。

1.DNase处理的核心必要性

    避免DNA模板引发的非特异性反应：残留的DNA模板可能通过两种途径干扰实验：

    一是在细胞内被核酸酶（如DNaseI）降解时，产生的DNA片段可能激活细胞的“天然免疫通路”（如TLR9通路，可识别双链DNA），引发炎症因子（如IFN-α、TNF-α）释放，导致细胞状态改变（如凋亡、应激反应），进而掩盖siRNA的特异性沉默效应；

    二是若DNA模板含启动子序列（如T7启动子），在体外转录后若未去除，后续实验中若存在RNA聚合酶，可能持续转录生成多余的RNA片段，污染siRNA样品。

    防止DNA与siRNA竞争结合靶点：部分DNA模板的序列可能与siRNA的靶mRNA存在同源性，残留的DNA可能通过碱基互补结合靶mRNA，形成DNA-RNA杂合链，这会直接抢占siRNA的结合位点，导致siRNA无法与RISC（RNA诱导沉默复合体）结合发挥作用，显著降低沉默效率。

 

2.DNase处理对siRNA活性的影响

DNase处理通过“清除DNA杂质”直接保障siRNA的活性，具体体现在两点：

    维持siRNA的特异性：去除DNA后，可避免“天然免疫激活”和“靶点竞争”导致的非特异性效应，确保实验中观察到的“基因沉默”是siRNA介导的特异性反应，而非DNA干扰的假阳性结果；

    提升siRNA的有效浓度：残留的DNA会占据反应体系中的“空间和资源”（如在转染时，DNA可能与siRNA竞争转染试剂，导致siRNA转染效率下降），去除DNA后，单位体积内的“有效siRNA浓度”升高，更易与RISC结合，进而提高沉默效率。

    注意：需选择“无RNase活性的DNase”（如DNaseIRNase-free），避免DNase降解siRNA本身；处理后需通过加热（如65℃10分钟）或添加EDTA终止DNase活性，防止后续反应中DNase持续作用。

二、为何必须进行磷酸酶处理？——去除异常磷酸化的RNA片段

    体外转录过程中，RNA聚合酶（如T7聚合酶）会在RNA链的5’端添加磷酸基团（天然mRNA的5’端为帽子结构，而体外转录的RNA5’端多为单磷酸或三磷酸）；同时，转录过程中可能产生“短片段RNA杂质”（如未完全延伸的正义链/反义链），这些片段的5’端或3’端可能携带磷酸基团。此外，RNA链的3’端可能因核酸酶降解产生磷酸基团。这些异常磷酸化的RNA片段会干扰siRNA的正常功能，需通过磷酸酶处理去除。

1.磷酸酶处理的核心必要性

    避免异常磷酸化干扰siRNA的RISC组装：siRNA发挥作用的关键步骤是“与RISC结合并解旋为单链RNA（ssRNA）”，而RISC对siRNA的磷酸化状态有严格要求——天然功能性siRNA的5’端为单磷酸基团，3’端为羟基（-OH）。若siRNA的5’端为三磷酸基团（体外转录常见产物），会阻碍RISC中的Argonaute蛋白（Ago2，RISC的核心组件）与siRNA结合，导致RISC组装失败；若3’端携带磷酸基团，可能引发核酸酶对siRNA的进一步降解，缩短其半衰期。

    去除短片段磷酸化RNA杂质：体外转录产生的“未完全延伸的短链RNA”（如10-15bp的片段），其5’端可能携带磷酸基团，这些片段虽无法形成完整的dssiRNA，但可能与RISC结合（竞争Ago2蛋白），或与靶mRNA的非特异性区域结合，导致“脱靶沉默”（off-targeteffect），干扰实验结果的准确性。磷酸酶可通过去除这些短片段的磷酸基团，使其失去与RISC结合的能力，同时降低其稳定性（去磷酸化的短链RNA更易被核酸酶降解）。

 

2.磷酸酶处理对siRNA活性的影响

    磷酸酶处理通过“规范siRNA的磷酸化状态”和“清除干扰性短片段”，直接保障siRNA的活性和特异性：

    确保RISC正常组装：将siRNA5’端的三磷酸基团转化为单磷酸基团（或通过特定磷酸酶去除多余磷酸），使其符合Ago2蛋白的结合要求，促进RISC组装，进而确保siRNA能正常解旋为单链并识别靶mRNA；

    降低脱靶效应：去除短片段RNA的磷酸基团后，这些杂质无法与RISC结合，减少了“非特异性沉默靶外基因”的概率，提升实验结果的可靠性；

    延长siRNA半衰期：去除3’端的磷酸基团后，siRNA不易被3’→5’核酸酶降解，在细胞内的存活时间延长，可更持久地发挥沉默作用。

 

常用磷酸酶类型：

    若需去除5’端三磷酸基团（转化为单磷酸），常用烟草酸性磷酸酶（TAP）；

    若需去除5’端或3’端的所有磷酸基团（转化为羟基），常用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）或虾碱性磷酸酶（SAP）；

    处理后需通过加热（如75℃10分钟，SAP可快速失活）或酚氯仿抽提去除磷酸酶，避免其影响后续退火步骤。

 

三、两步处理的核心价值

    体外转录法合成siRNA后，DNase和磷酸酶处理是“纯度控制”和“活性保障”的双重关键：

    DNase处理：解决“DNA模板残留”问题，避免非特异性免疫激活和靶点竞争，确保siRNA的特异性；

    磷酸酶处理：解决“异常磷酸化”问题，保障siRNA与RISC的正常结合，减少脱靶效应，提升沉默效率。

 

    若省略任一步骤，可能导致siRNA活性显著下降（如沉默效率低于30%），或出现严重的非特异性反应（如细胞死亡、多基因脱靶），最终使实验结果不可靠。因此，这两步是体外转录法合成siRNA的“标准化质控流程”，不可省略。