芯片法DNA合成产物的纯度普遍低于传统固相合成法,可通过哪些后续纯化步骤(如PAGE、超滤)提升纯度?
芯片法DNA合成产物可通过多种后续纯化步骤提升纯度,具体方法及特点如下:
首先是PAGE电泳纯化,其原理是基于DNA片段的分子量差异,在聚丙烯酰胺凝胶中实现分离,之后通过切胶回收目标片段。这种方法分辨率极高,能有效区分仅差1个碱基的片段,纯化后产物纯度可达95%以上,适用于对纯度要求严格的场景,比如长链DNA(>50nt)合成、基因组装或定点突变等。
其次是超滤纯化,利用特定分子量截留的滤膜,通过离心或加压方式去除小于截留分子量的杂质,如短片段、盐类等。该方法操作快速简便,无需接触有机溶剂,且能保留大部分目标产物,适合对纯度要求中等的场景,例如PCR引物合成、常规测序引物或短链DNA(<50nt)的纯化。
再者是HPLC纯化,以反相高效液相色谱(RP-HPLC)为主,基于DNA疏水性差异进行分离,目标片段与杂质因保留时间不同而被区分。其自动化程度高,可批量处理,纯度稳定(通常在90%-95%),还能在线监测,适用于中高纯度需求的规模化制备,如探针合成、芯片检测用DNA或批量引物生产。
另外还有磁珠纯化,利用磁珠表面的化学基团(如羧基、链霉亲和素)与DNA结合,通过洗涤去除杂质后洗脱目标片段。该方法操作灵活,可手动或自动化进行,且无需离心或电泳设备,适合高通量场景下的快速纯化,比如大规模PCR产物纯化、基因测序文库构建中的DNA片段筛选等。
选择纯化方法时,需结合产物长度、纯度需求和实验成本综合考量,例如长链或高纯度需求优先考虑PAGE或HPLC,短链或中等纯度需求可选择超滤,高通量场景则适合磁珠纯化。
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