双荧光实验中常用的两种荧光素酶是什么？它们的来源和发光特点分别是什么？

    在双荧光素酶报告基因实验（Dual-Luciferase Reporter Assay）中，常用的两种荧光素酶是萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase） 和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）。二者因来源不同，发光机制和特点存在显著差异，可通过特异性底物分别检测，从而实现实验信号的校准（如内参校正目的基因的表达）。

一、萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）

1、来源

    来源于萤火虫（常见物种为北美萤火虫 Photinus pyralis）的腹部发光器官，是一种由 550 个氨基酸组成的单体蛋白（分子量约 61 kDa）。其基因可通过基因工程手段在原核或真核细胞中表达。

2、发光特点

（1）底物与反应条件：

    以D - 荧光素（D-luciferin） 为特异性底物，反应需要ATP、Mg²⁺、O₂参与，且依赖细胞内的能量代谢（因需要 ATP）。

（2）发光波长：

    发射光峰值约为 560 nm（黄绿光），在不同 pH 条件下波长略有变化（酸性条件下偏红，碱性条件下偏绿）。

（3）动力学特征：

    反应为持续发光，但发光强度会随时间逐渐衰减（通常在反应启动后几秒内达到峰值，随后缓慢下降），因此需要在反应初期快速检测。

（4）应用角色：

    通常作为报告基因，与目的基因的启动子或调控序列偶联，用于检测目的基因的表达活性（如转录调控、启动子强度等）。

 

二、海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）

1、来源

    来源于海洋生物海肾（Renilla reniformis，一种腔肠动物），是一种由 311 个氨基酸组成的单体蛋白（分子量约 36 kDa），其基因同样可在多种表达系统中高效表达。

2、发光特点

（1）底物与反应条件：

    以腔肠素（coelenterazine） 为特异性底物，反应仅需要O₂参与，不依赖 ATP 或其他辅酶，对细胞代谢状态不敏感。

（2）发光波长：

    发射光峰值约为 480 nm（蓝光），发光波长稳定，受 pH 影响较小。

（3）动力学特征：

    反应为快速闪光，发光强度在数秒内达到峰值后迅速衰减（通常在 10 秒内完成检测），但可通过特定试剂延长发光时间。

（4）应用角色：

    通常作为内参基因，与组成型启动子（如 SV40 启动子）偶联，用于校正实验中的系统误差（如细胞转染效率、裂解效率差异等），使萤火虫荧光素酶的检测结果更可靠。

 

三、两种荧光素酶的核心差异对比

特征	萤火虫荧光素酶	海肾荧光素酶
来源	萤火虫（Photinus pyralis）	海肾（Renilla reniformis）
分子量	约 61 kDa	约 36 kDa
底物	D - 荧光素	腔肠素
反应依赖物	ATP、Mg²⁺、O₂	O₂（不依赖 ATP）
发光峰值波长	560 nm（黄绿光）	480 nm（蓝光）
发光动力学	持续发光，缓慢衰减	快速闪光，迅速衰减
主要作用	报告基因（检测目的基因活性）	内参基因（校正系统误差）

    双荧光素酶实验中，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶因底物特异性强、发光信号无交叉干扰，且分别对细胞代谢（依赖ATP）和非代谢条件（不依赖ATP）敏感，成为理想的 “报告基因 - 内参基因” 组合。这种设计能有效排除实验操作、细胞状态等无关变量的影响，显著提高基因表达或调控研究的准确性。