多克隆抗体定制的纯化方法有哪些？不同方法的纯度与特异性差异如何？

    多克隆抗体制备中纯化环节的关键选择。多克隆抗体定制常用的三种纯化方法在纯度和特异性上差异显著，核心区别在于是否基于抗原特异性结合，以及对抗体亚型的选择性。

一、三种核心纯化方法及操作特点

1、硫酸铵沉淀（Ammonium Sulfate Precipitation）

    原理：利用不同浓度硫酸铵使蛋白质（包括抗体）在溶液中溶解度降低而沉淀，实现初步分离。

    操作特点：步骤简单，成本低，仅需通过离心收集沉淀、复溶后透析去除盐离子；属于非特异性纯化，不针对抗体本身的结构或抗原结合位点。

 

2、Protein A/G纯化（Protein A/G Purification）

    原理：Protein A/G是能特异性结合抗体Fc段（恒定区）的蛋白，通过亲和层析柱捕获样本中的抗体，再用洗脱液（如低pH缓冲液）将抗体洗脱。

    操作特点：无需依赖抗原，适用于多种物种（如兔、鼠、人）的IgG类抗体；属于半特异性纯化，仅针对抗体的Fc段，不区分抗体的抗原结合特异性。

 

3、抗原亲和纯化（Antigen Affinity Purification）

    原理：将制备抗体时使用的特异性抗原偶联到亲和层析柱上，样本中的目标抗体（能与该抗原结合）会被特异性捕获，再通过洗脱液解离得到纯化抗体。

    操作特点：需提前制备或获取足量纯抗原，步骤相对复杂，成本较高；属于完全特异性纯化，直接针对抗体的抗原结合位点（Fab段）。

二、纯度与特异性差异对比

    三种方法的核心差异体现在“是否去除非目标抗体及杂蛋白”，最终决定纯度和特异性的高低。

1、纯度差异：抗原亲和纯化>Protein A/G纯化>硫酸铵沉淀

    硫酸铵沉淀：纯度最低。仅能去除部分白蛋白、小分子杂蛋白，无法分离样本中的非目标抗体（如与制备抗原无关的其他抗体），纯化后产物是“混合免疫球蛋白+残留杂蛋白”，纯度通常在40%-60%。

    ProteinA/G纯化：纯度中等。可特异性捕获IgG类抗体，去除大部分杂蛋白（如白蛋白、酶类），但会保留样本中所有能结合ProteinA/G的IgG（包括非目标抗体，如动物自身产生的无关抗体），纯度通常在80%-95%。

    抗原亲和纯化：纯度最高。仅保留能与目标抗原结合的抗体，几乎去除所有非目标抗体、杂蛋白，纯化后产物以“特异性抗目标抗原的多克隆抗体”为主，纯度可达到95%以上，部分场景下能接近99%。

 

2、特异性差异：抗原亲和纯化>Protein A/G纯化>硫酸铵沉淀

    硫酸铵沉淀：特异性最低。纯化产物中包含大量非目标抗体和杂蛋白，用于检测（如ELISA、Western Blot）时易与样本中的其他成分非特异性结合，导致背景信号高、假阳性风险大。

    Protein A/G纯化：特异性中等。虽去除了杂蛋白，但保留了非目标IgG，若这些非目标IgG与检测样本中的成分存在交叉反应，仍会产生一定背景信号；仅适用于对特异性要求不高的场景（如作为二抗的前体纯化）。

    抗原亲和纯化：特异性最高。纯化后的抗体仅针对目标抗原，与其他无关蛋白的交叉反应极少，检测时背景信号低、结果准确性高；适用于对特异性要求严格的场景（如免疫沉淀、免疫荧光定位）。

 

三、方法选择建议

    优先选抗原亲和纯化：若实验需要高特异性（如检测低丰度目标蛋白、避免交叉反应），且能提供足量纯抗原，即使成本较高，也建议选择此方法。

    次选Protein A/G纯化：若仅需获得高纯度IgG（无需严格特异性），或暂无法提供纯抗原（如抗原制备难度大），可选择此方法，兼顾纯度与操作便捷性。

    仅用硫酸铵沉淀：通常作为“预处理步骤”，而非最终纯化方法。例如，先通过硫酸铵沉淀浓缩样本中的抗体，再用Protein A/G或抗原亲和纯化进一步提纯，降低后续纯化的样本量压力。