siRNA合成的核心化学原理是什么？固相亚磷酰胺法在siRNA合成中如何实现核苷酸的逐步偶联？

    siRNA合成的核心化学原理是通过核苷酸单体的逐步共价连接构建RNA链，其关键在于解决核糖 2'- 羟基的高反应活性问题，并通过保护基团调控反应特异性。目前主流的化学合成方法为固相亚磷酰胺法，该方法在固相载体上实现核苷酸的定向偶联，具体过程如下：

一、siRNA合成的核心化学原理

    siRNA是由两条互补RNA链组成的双链分子，每条链的合成均依赖核苷酸单体的磷酸二酯键连接。与DNA合成相比，RNA 合成的特殊挑战在于核糖的 2'- 羟基（-OH）具有高反应活性，易在合成过程中参与副反应（如自身环化或错误偶联）。因此，siRNA 合成的核心是通过选择性保护 2'- 羟基（如使用酸敏感的保护基团），确保核苷酸仅通过 3'- 羟基与下一个单体的 5'- 磷酸基团形成磷酸二酯键，从而实现 RNA 链的定向延伸。

二、固相亚磷酰胺法在siRNA合成中的逐步偶联过程

    该方法以固相载体（如可控孔度玻璃CPG树脂）为固相支持物，通过以下步骤实现核苷酸的逐步偶联（以单链 RNA 合成为例）：

1、固相载体预处理

    第一条核苷酸单体（3'- 端起始单体）通过 3'- 羟基共价连接到固相载体上，其 2'- 羟基被暂时性保护基团（如叔丁基二甲基硅基TBDMS或三氟乙酰基TFAA）封闭，避免副反应。

2、脱保护（去三苯甲基）

    用三氟乙酸（TFA）处理连接在载体上的核苷酸，去除其 5'- 羟基上的二甲氧基三苯甲基（DMT）保护基团，暴露 5'- 羟基，为下一步偶联做准备。

3、偶联反应

    将活化的亚磷酰胺单体（含目标碱基，且 5'- 端带 DMT 保护、2'- 端带保护基团）与固相载体上的核苷酸反应。在活化剂（如四唑）作用下，亚磷酰胺单体的 3'- 磷酸基团与固相上核苷酸的 5'- 羟基形成亚磷酸三酯中间体，实现两个核苷酸的连接。此步骤是偶联效率的关键，需控制反应时间（通常30-120秒）以确保效率>99%。

4、盖帽（Capping）

    用乙酸酐和N-甲基咪唑处理未反应的5'-羟基，使其乙酰化，避免后续反应中这些游离羟基参与非特异性偶联，减少短片段杂质。

5、氧化

    用碘溶液将亚磷酸三酯中间体氧化为稳定的磷酸二酯键，形成RNA链骨架的特征结构。

6、循环延伸

    重复步骤2-5（脱保护→偶联→盖帽→氧化），按预设序列依次添加核苷酸，使 RNA 链从 3'→5' 方向逐步延伸至目标长度。

7、切割与脱保护

    合成完成后，用浓氨水（或甲基胺）处理固相载体，将合成的RNA链从载体上切割下来，并去除所有保护基团（包括2'- 羟基的保护基团和碱基上的保护基团）。

8、纯化与退火

    通过PAGE或HPLC纯化单链RNA，去除短片段、未完全脱保护的杂质，最终将正义链与反义链退火形成双链siRNA。

 

    固相亚磷酰胺法通过固相载体固定、保护基团精准调控和循环偶联反应，实现了siRNA的高效化学合成。其核心优势在于可精确控制序列、引入化学修饰（如2'-F、硫代磷酸酯），且适合自动化合成，是目前制备高纯度、定制化siRNA主流方法。