RT-PCR检测外泌体RNA的流程是怎样的？

    RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）检测外泌体RNA是研究外泌体中核酸信息的核心技术，需严格控制外泌体纯化、RNA提取、逆转录及PCR扩增等关键步骤，以避免污染和假阳性/假阴性结果。以下是详细流程，按实验阶段拆解说明：

一、实验前准备：耗材与试剂选择

   外泌体RNA含量极低（通常每个外泌体仅含1-10条RNA），且易受环境中游离RNA或RNase（RNA酶）污染，需优先选择无RNase污染的耗材和试剂：

    耗材：无RNase离心管（1.5mL/50mL）、无RNase吸头、0.22μm 滤膜（用于外泌体纯化除杂）；

    试剂：

        外泌体纯化试剂（如超速离心缓冲液 PBS、商业外泌体提取试剂盒；

        RNA提取试剂（RNAiso for Small RNA，需适配外泌体中可能的小 RNA，如 miRNA）；

        逆转录试剂盒（含逆转录酶、dNTPs、RNase 抑制剂、随机引物/特异性引物）；

        qPCR试剂盒（含 Taq 酶、SYBR Green I /探针、ROX参比染料、无酶水）；

        对照品（如外泌体阳性对照、RNA提取阴性对照、无模板对照NTC）。

二、核心流程：分 4 个关键阶段

阶段 1：外泌体纯化（关键：去除游离 RNA 和杂质）

    外泌体存在于体液（血清、血浆、尿液）或细胞培养上清中，需先纯化以排除游离 RNA、蛋白质、脂蛋白等干扰，常用纯化方法包括超速离心法（经典金标准）和商业试剂盒法（便捷高效），流程如下：

    样本预处理：

        体液样本（如血清）：4℃下 10,000×g 离心 20 分钟，去除细胞碎片和大囊泡；取上清过 0.22μm 滤膜，进一步去除直径＞220nm 的杂质；

        细胞培养上清：先 3,000×g 离心 10 分钟去除细胞，再按上述步骤离心 + 滤膜过滤。

    外泌体纯化：

        超速离心法（推荐用于高纯度需求）：将预处理后的上清转移至超速离心管，4℃下 100,000×g 离心 70-90 分钟；弃上清，用无 RNase PBS 重悬沉淀，再次 100,000×g 离心 70 分钟，最终得到纯化外泌体。

        试剂盒法（推荐用于快速实验）：按试剂盒说明书（如 ExoQuick）将上清与提取试剂按比例混合，4℃孵育 12-16 小时，随后 3,000×g 离心 30 分钟，弃上清，用无 RNase PBS 重悬沉淀即可。

    外泌体鉴定（可选但推荐）：通过 Western Blot 检测外泌体标志蛋白（如 CD63、CD81、TSG101），或通过纳米颗粒追踪分析（NTA）检测粒径（30-150nm），确认纯化效果。

 

阶段 2：外泌体 RNA 提取（关键：避免 RNase 降解）

    外泌体膜结构需裂解后释放 RNA，且需严格抑制 RNase 活性，流程如下：

    外泌体裂解：将纯化后的外泌体重悬液与RNA提取试剂（如 TRIzol™ LS）按比例混合（通常 1mL TRIzol™ LS 处理 100μL 外泌体重悬液），涡旋振荡 30 秒，室温静置 5 分钟，使外泌体膜充分裂解。

    蛋白去除：加入氯仿（按 1mL TRIzol™ LS 加 0.2mL 氯仿），剧烈振荡 15 秒，室温静置 2-3 分钟，4℃下 12,000×g 离心 15 分钟；此时溶液分层，上层水相（含 RNA） 转移至新的无 RNase 离心管（避免吸到中间蛋白层）。

    RNA 沉淀：加入等体积异丙醇（如上层水相 0.5mL，加 0.5mL 异丙醇），轻轻颠倒混匀，-20℃静置 30 分钟（或 4℃静置 2 小时），使 RNA 充分沉淀；4℃下 12,000×g 离心 10 分钟，弃上清，可见管底白色 RNA 沉淀。

    RNA 洗涤与溶解：用 75% 无 RNase 乙醇（按 1mL TRIzol™ LS 加 1mL 乙醇）洗涤沉淀，4℃下 7,500×g 离心 5 分钟，弃上清；重复洗涤 1 次，室温晾干沉淀（避免完全干透，否则难溶解）；加入 20-50μL 无 RNase 水或 TE 缓冲液，轻轻吹打溶解 RNA。

    RNA 质量检测：用 Nanodrop 检测 RNA 纯度（A260/A280 应在 1.8-2.1 之间），用琼脂糖凝胶电泳或 Agilent 2100 检测 RNA 完整性（外泌体 RNA 以小 RNA 为主，如 miRNA，电泳可见100-200nt条带）。

 

阶段 3：逆转录（RT）：将RNA转为cDNA

    外泌体RNA多为小RNA（如 miRNA、tsRNA）或低丰度 mRNA，需选择适配的引物（随机引物、oligo (dT) 或特异性引物），流程如下（以 20μL 反应体系为例）：

试剂组分	体积（20μL 体系）	作用
无 RNase 水	补足至 20μL	定容
5×逆转录缓冲液	4μL	提供酶促反应环境
dNTP 混合物（10mM each）	2μL	提供 DNA 合成原料
RNase 抑制剂（40U/μL）	0.5μL	抑制 RNase 降解 RNA
逆转录酶（200U/μL）	1μL	将 RNA 逆转录为 cDNA
引物（随机引物/特异性）	1μL（10μM）	结合 RNA，启动逆转录
外泌体RNA模板	10-15μL	待逆转录的 RNA

    逆转录反应程序（按试剂盒说明书调整）：

        若为miRNA：通常先 42℃孵育 30 分钟（逆转录），再 85℃加热 5 分钟（灭活逆转录酶）；

        若为mRNA：用 oligo (dT) 引物时，42℃孵育 60 分钟，85℃加热 5 分钟。
    cDNA 保存：反应结束后，cDNA 可立即用于 PCR，或 - 20℃保存（短期）/-80℃保存（长期）。

阶段 4：PCR 扩增与检测（关键：定量与质控）

    根据研究目的选择普通PCR（定性检测）或实时荧光定量PCR（qPCR）（定量检测），常用qPCR分析外泌体 RNA 的相对表达量，流程如下：

    qPCR 反应体系配制（20μL 体系，冰上操作）：

试剂组分	体积（20μL 体系）	作用
2×qPCR 混合液（含 Taq 酶、SYBR Green）	10μL	提供 PCR 扩增酶和荧光信号
上游引物（10μM）	0.8μL	结合 cDNA 上游序列
下游引物（10μM）	0.8μL	结合 cDNA 下游序列
无酶水	7.4μL	定容
cDNA 模板	1μL	待扩增的 cDNA（稀释 5-10 倍避免抑制）

    设置对照（必须，排除污染）：

        无模板对照（NTC）：用无酶水替代 cDNA，检测试剂是否污染；

        阴性对照：用不含外泌体的样本（如无血清培养基）提取 RNA 并逆转录，检测样本是否污染；

        阳性对照：用已知含目标 RNA 的外泌体 cDNA，验证反应有效性。

    qPCR 反应程序：

        预变性：95℃ 30秒（激活Taq酶，变性cDNA）；

        扩增循环（40个循环）：95℃ 5秒（变性）→ 60℃ 30 秒（退火 + 延伸，采集荧光信号）；

        熔解曲线分析：95℃ 15 秒 → 60℃ 1 分钟 → 95℃ 15 秒（验证产物特异性，单一峰为特异性扩增）。

    结果分析：

        定性：普通 PCR 需电泳检测，出现目标条带为阳性；

        定量：qPCR 通过 Ct 值（荧光信号达到阈值的循环数）计算相对表达量，常用 2^(-ΔΔCt) 法，需选择外泌体中稳定表达的内参基因（如 U6 snRNA 用于 miRNA，GAPDH 用于 mRNA）。

三、关键注意事项（避免实验失败）

    RNase污染控制：全程使用无 RNase 耗材，操作时戴无粉手套并频繁更换，台面用 RNase 抑制剂（如 RNase Zap）擦拭；

    外泌体纯度：若游离RNA污染严重，可在纯化后用RNase A处理（37℃孵育 30 分钟），再用 RNase 抑制剂灭活，去除外泌体外的游离RNA；

    引物设计：针对小RNA（如 miRNA）需设计特异性茎环引物，避免非特异性扩增；

    重复性验证：每个样本至少设置3个技术重复，确保结果可靠。

    通过以上流程，可高效、准确地检测外泌体RNA的存在与表达水平，为外泌体的疾病诊断（如肿瘤标志物检测）或功能研究提供依据。