大规模工业级RNA合成（如吨级mRNA生产）与实验室小规模合成在反应体系、纯化工艺上有哪些关键差异？核心技术瓶颈是什么？

  大规模工业级RNA合成与实验室小规模合成在反应体系和纯化工艺上存在诸多关键差异，同时也面临着一些核心技术瓶颈，具体如下：

一、反应体系差异

    反应容器与温控：实验室小规模合成通常使用PCR仪、金属浴、水浴锅或恒温摇床等，反应体积较小，如小于1ml的体系常用PCR仪或金属浴保温，1ml至几十ml体系可用水浴锅或恒温摇床，温度控制相对较为简单。而大规模工业级合成则通常选用一次性无核酸酶袋作为反应容器，搭配摇摆式生物反应器、搅拌式生物反应器或一次性配液系统等，需要精确控制温度、pH值、搅拌速度等参数，以确保大规模反应体系的均匀性和稳定性。

    原料用量与浓度：工业级生产由于需要达到吨级产量，原料的用量会大幅增加，各种核苷酸、酶等原料的投入量远高于实验室规模。而且为了提高生产效率和降低成本，可能会采用更高浓度的反应底物，但这也需要考虑酶的活性、反应动力学等因素，以避免底物抑制等问题。

    反应时间与效率：工业级生产希望在尽可能短的时间内获得大量的RNA产物，因此会通过优化反应条件，如筛选高效的RNA聚合酶、调整反应温度和pH值等，来提高反应速率和效率，缩短反应时间。而实验室小规模合成更注重对反应过程和机制的研究，反应时间可能相对较长。

二、纯化工艺差异

    纯化方法的选择与组合：实验室小规模合成可能采用较为简单的纯化方法，如单一的亲和层析或离子交换层析等。而工业级生产为了获得高纯度的RNA产品，通常会采用多种纯化方法的组合，如先使用polydT亲和层析去除大部分杂质，再结合离子交换层析、多模式层析等进一步纯化，最后通过切向流过滤进行浓缩和换液。

    纯化设备的规模与性能：工业级纯化需要使用大型的层析柱、切向流过滤设备等，这些设备需要具备更高的处理能力和稳定性，以满足大规模生产的需求。例如，切向流过滤需要根据RNA分子的稳定性和吸附特性选择合适的膜包或中空纤维，并且要考虑膜面积、跨膜压等参数，以确保在大规模纯化过程中RNA的回收率和纯度。

    杂质去除的严格程度：工业级生产对杂质的去除要求更为严格，需要严格控制产品相关杂质（如dsRNA、截断的RNA片段等）和工艺相关杂质（如T7聚合酶、焦磷酸酶、DNA酶等）的含量，以保证RNA产品的质量和安全性。例如，要求dsRNA含量＜0.1%甚至更低。

 

三、核心技术瓶颈

    酶的性能优化：RNA聚合酶的稳定性和活性是关键。需要通过定点突变等技术改造T7RNA聚合酶，提高其在高温下的稳定性，延长半衰期，同时降低副产物dsRNA的生成量，以提高mRNA的产量和质量。

    规模化制备技术：如LNP制备依赖批次式微流控设备，难以放大至万升规模，需要开发连续流微射流混合系统，解决纳米颗粒尺寸分布不均的问题，实现包封率稳定且高效。

    纯化工艺优化：构建高效的连续纯化工艺，将mRNA纯度提升至99.9%以上，同时有效去除宿主细胞DNA残留、核酸酶污染物等，确保产品的安全性和质量稳定性。

    质量控制与监测：开发实时监测系统，如实时荧光定量PCR与近红外光谱联用的在线监测系统，实现对IVT反应效率、LNP粒径及mRNA完整性等关键质量属性的实时调控，保证批间差异小，实现全流程自动化控制。