双荧光素酶试剂盒的试剂组分通常包含哪些？裂解液的作用机制是什么？

一、双荧光素酶试剂盒的常见试剂组分

    双荧光素酶报告基因检测试剂盒的核心是两种荧光素酶的检测体系（萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶），以及配套的样品处理和质控试剂，不同品牌组分略有差异，但核心组分一致，具体如下：

 

1、细胞裂解液（LysisBuffer）

    这是用于破碎细胞、释放胞内两种荧光素酶的关键试剂，通常含非离子型去污剂（如TritonX-100、NP-40）、缓冲盐（如Tris-HCl）、保护剂（如BSA、甘油），部分还会添加少量EDTA抑制金属蛋白酶活性。

 

2、萤火虫荧光素酶检测试剂（LARII，LuciferaseAssayReagentII）

    用于检测萤火虫荧光素酶的活性，核心成分包括：

    荧光素（萤火虫荧光素酶的底物）；

    ATP（荧光素酶催化反应的能量物质）；

    缓冲体系（维持反应pH，通常为中性偏碱）；

    辅助因子（如Mg²⁺，荧光素酶的激活剂）。

    该试剂需避光保存，且多为即用型

 

3、海肾荧光素酶检测试剂（Stop&Glo®Reagent）

    兼具两个功能：终止萤火虫荧光素酶反应+启动海肾荧光素酶反应，核心成分包括：

    腔肠素（海肾荧光素酶的特异性底物）；

    反应终止剂（如高浓度还原剂或去污剂，快速灭活萤火虫荧光素酶）；

    适配海肾荧光素酶的缓冲体系（通常为弱碱性）。

 

4、阳性对照试剂（可选）

    部分试剂盒会提供萤火虫荧光素酶标准品和海肾荧光素酶标准品，用于绘制标准曲线、验证检测体系的可靠性；也可能提供含两种报告基因的阳性对照质粒，用于转染效率质控。

 

5、稀释缓冲液（OptionalBuffer）

    用于稀释裂解后的样品、标准品或检测试剂，避免因样品浓度过高导致信号溢出，通常为不含去污剂的温和缓冲液。

二、裂解液的作用机制

    双荧光素酶检测的前提是将细胞内的两种荧光素酶完整释放到溶液中，且保持其天然构象和酶活性，裂解液的作用机制围绕这一目标展开，主要分为3个方面：

 

1、破坏细胞膜与核膜结构

    裂解液中的非离子型去污剂（如TritonX-100）是核心功能成分，其分子结构包含疏水端和亲水端：疏水端插入细胞膜的磷脂双分子层，亲水端暴露在水溶液中，通过破坏磷脂分子的排列方式，使细胞膜、核膜形成孔洞并最终破裂，从而释放胞内的荧光素酶（包括细胞质中的萤火虫荧光素酶和细胞核/细胞质中的海肾荧光素酶）。

    非离子型去污剂的优势是温和裂解，不会导致蛋白质变性，能最大程度保留荧光素酶的活性。

 

2、维持酶活性的稳定环境

    裂解液中的缓冲盐（如Tris-HCl）可维持裂解后溶液的pH稳定（通常为7.5–8.0），该pH范围是两种荧光素酶的最适活性pH，避免pH波动导致酶失活。

    添加剂如BSA（牛血清白蛋白）可作为“分子伴侣”，包裹荧光素酶分子，防止其在溶液中聚集变性；甘油能降低溶液的极性，减少酶分子的疏水相互作用，进一步维持构象稳定。

    少量EDTA可螯合溶液中的重金属离子（如Fe³⁺、Cu²⁺），这些离子会氧化酶的活性中心或破坏肽键，EDTA通过螯合作用抑制其对酶的损伤。

 

3、抑制内源性蛋白酶活性

    细胞裂解后，胞内的蛋白酶会被释放并可能降解荧光素酶，裂解液中可能添加的蛋白酶抑制剂（如PMSF、抑肽酶），或通过温和的缓冲环境降低蛋白酶活性，从而保护荧光素酶不被降解，确保检测信号的准确性。