外泌体miRNA测序研究全套实验步骤包含哪些？

    整套实验分为样本制备→外泌体分离与质控→外泌体总 RNA 提取→RNA 质控→文库构建→上机测序→生物信息分析七大模块，每个环节均有强制质控节点，缺一不可，完整流程如下：

一、样本收集与前期预处理

    样本采集

    细胞上清：细胞用无外泌体胎牛血清培养基培养 24–48 h，收集培养液；临床样本：血清、血浆、脑脊液、尿液，全程避免溶血、反复冻融，采血后 2 h 内完成初步离心。

    梯度预离心去除杂质

    300 g 10 min：去除完整活细胞；

    2000 g 20 min：去除凋亡细胞、大细胞碎片；

    10000 g 30 min：清除微囊泡、细胞器碎片；
    收集上清，立即用于外泌体提取或 - 80℃分装保存。

 

二、外泌体分离与三重鉴定（测序前置强制质控）

    测序对囊泡纯度要求极高，杂质 RNA 会彻底干扰 miRNA 测序结果，必须完成鉴定再提 RNA。

    外泌体纯化：超速离心法（110000 g，70 min）或尺寸排阻色谱试剂盒纯化，PBS 重悬沉淀。

    三项标准鉴定：

    ① NTA：检测粒径 30–150 nm，统计颗粒浓度；

    ② 透射电镜：观察典型杯状囊泡形态；

    ③ Western Blot：检测外泌体标志物 CD9、CD63、TSG101 阳性，Calnexin（细胞内质网蛋白）阴性，证明无细胞碎片污染。

    仅鉴定合格的外泌体样本，才能进入 RNA 提取环节。

 

三、外泌体总 RNA 提取（富集 miRNA 专用）

    普通细胞 RNA 提取试剂盒会丢失小分子 miRNA，必须选用外泌体专用小 RNA 提取试剂盒：

    裂解：外泌体沉淀加入裂解液，室温充分裂解囊泡，释放内部 RNA；

    相分离：加入氯仿震荡分层，离心取上层水相（含 RNA）；

    沉淀纯化：异丙醇 + 糖原共沉淀小分子 RNA，75% 乙醇洗涤去除盐离子；

    无酶 DEPC 水重溶 RNA 沉淀，全程低温、无核酸酶污染操作。

 

四、RNA 质量检测（两轮质控，筛选合格样本建库）

    浓度检测：Qubit 荧光定量，测定总 RNA 浓度；

    完整性与片段分布：琼脂糖凝胶电泳 / 毛细管电泳（Agilent 2100），合格样本可见明显 18–30 nt 小 RNA 富集条带，无大片段核糖体 RNA 污染；

    纯度检测：Nanodrop 测 OD260/280、OD260/230，比值在 1.8–2.1 区间为合格；

    RNA 降解、杂质污染严重样本直接剔除，不进行文库构建。

 

五、小 RNA 文库构建（miRNA 测序核心步骤）

    3’端接头连接：特异性接头结合 miRNA 3’羟基端；

    5’端接头连接：连接另一端接头，为后续扩增、测序提供结合位点；

    反转录：以连接双接头的 RNA 为模板，合成 cDNA 第一链；

    PCR 扩增：引入测序引物与样本特异性 Barcode（区分不同样本），循环扩增富集目的片段；

    片段筛选纯化：凝胶切胶筛选 140–160 bp 片段（对应成熟 miRNA 长度），去除引物二聚体、大片段杂质；

    文库质控：Qubit 定量、2100 检测文库片段分布，合格文库混合统一浓度备用。

 

六、Illumina 平台上机高通量测序

    将混合文库加载至测序芯片，采用单端测序模式，常规选择 SE50 测序策略，读取每条小 RNA 序列信息，原始测序数据（Raw Reads）下机后进入生信分析。

 

七、生物信息学分析流程

    原始数据质控：去除低质量 reads、接头序列、污染序列，得到纯净 Clean Reads；

    长度筛选：筛选 18–30 nt 片段，匹配成熟 miRNA 长度；

    序列比对：比对参考基因组、miRBase 数据库，鉴定已知 miRNA；未匹配序列预测新型 miRNA；

    表达量定量：统计各 miRNA 表达丰度，TPM 标准化处理消除测序深度差异；

    差异 miRNA 筛选：实验组 vs 对照组，筛选 FC≥2、P＜0.05 的显著差异 miRNA；

    功能富集分析：

        TargetScan、miRanda 预测 miRNA 靶基因；

        GO 功能注释、KEGG 通路富集，锁定疾病相关调控通路；

    蛋白互作网络（PPI）、miRNA-mRNA 调控网络可视化绘图。

 

八、后期实验验证（测序数据落地必备，不属于测序流程但为完整研究标配）

    qRT-PCR 扩大样本验证：挑选 3–10 个关键差异 miRNA，用 cel-miR-39、U6 作为内参验证测序表达趋势；

    分子机制验证：双荧光素酶报告基因验证 miRNA 与靶基因靶向结合；

    细胞功能实验：mimic/inhibitor 转染，检测细胞增殖、迁移、炎症等表型。

    全流程最容易出问题的节点集中在外泌体纯度与 RNA 提取两步：细胞碎片会带入大量细胞内源 RNA，掩盖外泌体特异性 miRNA；普通 RNA 试剂盒会损失低丰度小 RNA，直接导致测序数据失真，是实验失败最常见原因。整套流程从样本到生信分析环环质控，才能获得可靠、可重复的外泌体 miRNA 测序结果。