siRNA合成的最终产物中出现碱基缺失，可能的原因有哪些？

    在siRNA合成过程中，最终产物出现碱基缺失（通常表现为n-1、n-2等截短片段杂质），本质是合成反应未按预期完成全长延伸，或后续处理导致片段断裂，核心原因可从合成反应本身、原料与试剂、后处理过程三个维度追溯；而通过针对性的质量控制（QC）步骤，可在产物纯化前或纯化后提前识别碱基缺失问题，避免影响后续实验（如RNA干扰效率）。

一、siRNA合成产物出现碱基缺失的核心原因

    siRNA的化学合成采用“固相亚磷酰胺法”，需经过多轮“脱保护-偶联-氧化-封端”循环（每轮添加1个碱基），任何一轮循环的异常都可能导致延伸中断，产生碱基缺失的截短体；此外，后续处理中的不当操作也可能造成片段断裂，具体原因如下：

1、合成反应循环中的关键异常（最主要原因）

    固相合成的每一步循环直接决定是否能完成全长延伸，以下环节异常会直接导致碱基缺失：

    偶联效率不足：偶联是每轮添加碱基的核心步骤（亚磷酰胺单体与固相载体上的siRNA链末端羟基反应），若偶联效率低于99%（理想效率需≥99.5%），多轮循环后会累积大量截短体（如21nt的siRNA经20轮循环后，偶联效率99%会导致约18%的n-1杂质）。常见导致偶联效率低的因素包括：亚磷酰胺单体纯度不足（如含水解杂质）、活化剂（如四氮唑）失效或浓度不足、反应温度不当（通常需25-30℃，温度过低会减慢反应速率）、反应时间过短（常规偶联需2-5min，复杂序列如含G-G配对需延长至10min）。

    封端步骤失效：封端的目的是将未完成偶联的siRNA链末端羟基（即可能形成截短体的链）乙酰化，阻止其参与后续循环（避免继续延伸形成“错误长度片段”）。若封端试剂（如乙酸酐、N-甲基咪唑）浓度不足、反应时间过短（需1-2min）或混合不均匀，未偶联的链会保留活性，在后续循环中可能继续延伸，但因前期缺失1个碱基，最终形成n-1的截短体（而非全长）。

    脱保护不完全：每轮偶联前需去除siRNA链末端的5’-DMT保护基（用三氟乙酸处理），若脱保护时间过短（常规需30-60s）、三氟乙酸浓度降低（如反复使用导致稀释）或固相载体局部接触不均，部分链的5’-DMT保护基未完全去除，无法参与下一轮偶联，导致延伸中断，形成截短体。

 

2、原料与试剂的质量问题

    原料纯度或稳定性不足会间接导致延伸异常，产生碱基缺失：

    亚磷酰胺单体质量缺陷：单体是合成的“基础单元”，若单体含水分（导致水解生成无活性的磷酸酯）、纯度低于98%（含杂质干扰偶联），或储存不当（如未避光、未在-20℃密封保存，导致单体降解），会直接降低偶联效率，增加截短体比例；此外，若单体序列错误（如错配碱基），虽不直接导致“缺失”，但可能伴随延伸异常，间接产生截短杂质。

    溶剂与试剂污染或降解：合成中使用的无水乙腈（溶解单体）若吸水（含水量>0.1%），会水解亚磷酰胺单体和活化剂；氧化试剂（如碘溶液）若过期或浓度降低，会导致亚磷酸三酯中间体氧化不完全，影响链的稳定性，后续处理中可能断裂形成短片段；甚至固相载体（如可控孔度玻璃CPG）若有破损，会导致部分siRNA链提前脱落，形成未完成延伸的截短体。

 

3、后处理与纯化过程中的片段断裂

    即使合成过程未产生碱基缺失，后续从固相载体上切割、脱保护或纯化时，也可能因操作不当导致siRNA链断裂：

    切割与脱保护条件剧烈：合成完成后，需用浓氨水（如28%氨水）在55℃下切割siRNA链（从CPG载体上脱离）并脱除碱基上的保护基（如Bz、iBu），若氨水浓度过高、加热时间过长（常规需8-12h，超过16h可能导致链断裂）或温度过高（>60℃），会破坏siRNA的磷酸二酯键，导致链断裂，形成碱基缺失的短片段。

    纯化过程中的物理或化学损伤：若采用柱层析（如反相柱）纯化时，流动相pH过低（如<2.0）或有机相比例过高（如>50%乙腈），可能导致siRNA链局部变性或断裂；若使用离心浓缩仪时转速过高、温度过高（>40℃），也可能因机械力或热效应导致片段断裂，产生缺失杂质。

二、通过质量控制步骤提前发现碱基缺失的方法

    针对siRNA合成的不同阶段（合成中、合成后纯化前、纯化后）设计QC步骤，可提前识别碱基缺失问题，避免不合格产物进入下游实验，核心QC手段包括实时监测合成过程、快速定性分析、精准定量分析三类：

1、合成过程中的实时监测：提前预警延伸异常

    通过监测每轮合成的关键指标，可在截短体大量产生前发现问题，及时调整参数：

    DMT离子浓度监测（最常用）：每轮脱保护步骤中，5’-DMT保护基被三氟乙酸去除后会释放DMT阳离子（在495nm处有吸收），通过紫外检测器实时检测DMT离子的吸光度值。若某一轮的吸光度值显著低于前一轮（如下降>10%），说明该轮偶联效率低（未偶联的链少，释放的DMT离子少），可能产生大量n-1截短体，需立即暂停合成，检查单体、活化剂浓度或反应时间，避免后续循环累积更多杂质。

    循环参数记录与追溯：对每轮合成的温度、反应时间、试剂用量（如单体加入体积）进行详细记录，若某一批次siRNA出现碱基缺失，可通过追溯参数排查是否存在“偶联时间过短”“脱保护温度异常”等问题，为后续优化提供依据。

 

2、合成后纯化前的快速定性：初步判断是否存在截短体

    合成完成并切割脱保护后，先通过简单的分离方法快速筛查，避免直接进入复杂纯化步骤（节省成本）：

    变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（denaturingPAGE）：siRNA为短链核酸（通常21-23nt），变性PAGE（含尿素，破坏RNA二级结构）可通过分子量差异分离全长siRNA与截短体（n-1片段比全长短1nt，电泳迁移速度更快）。将样品上样后电泳，用溴化乙锭（EB）或SYBRGreen染色，若凝胶上出现2条及以上条带（除全长条带外，还有迁移更快的短条带），说明存在碱基缺失的截短体；若仅出现单一条带，可初步判断截短体含量低，再进入后续纯化。该方法优点是操作简单、成本低，可快速定性，但无法准确定量杂质比例。

    毛细管电泳（CE）：相比PAGE，CE分离效率更高、分析速度更快（10-15min/样品），通过毛细管内的凝胶或溶液相分离，根据迁移时间区分长短片段（全长siRNA迁移时间长，截短体短）。若CE图谱中出现多个峰（除主峰外还有小峰），且小峰迁移时间早于主峰，说明存在碱基缺失杂质，可初步评估杂质的大致比例（峰面积占比），适合高通量样品的快速筛查。

 

3、纯化后的精准定量：确定碱基缺失杂质含量（关键QC步骤）

    纯化（如HPLC纯化、反相柱纯化）后，需通过高精度方法准确定量截短体含量，确保产物符合实验要求（通常siRNA纯度需≥95%，截短体杂质<5%）：

    反相高效液相色谱（RP-HPLC）：如前序HPLC分析DNA的原理类似，siRNA的碱基含弱疏水性，全长siRNA疏水性强，在反相柱（如C18柱）上保留时间长，截短体疏水性弱，保留时间短。通过优化流动相梯度（如乙腈/三氟乙酸水溶液梯度），可实现全长与截短体的完全分离，再通过260nm紫外检测峰面积，计算截短体杂质的比例（杂质峰面积/总峰面积×100%）。若杂质比例>5%，说明纯化不彻底或合成过程存在严重问题，需重新优化合成或纯化条件。

    质谱分析（如ESI-MS）：质谱可直接测定siRNA的分子量，全长siRNA的理论分子量可通过碱基组成计算（如21ntsiRNA的分子量约6700-7000Da），若质谱图中出现分子量比理论值小329Da左右的峰（1个核苷酸的分子量约329Da），说明存在n-1截短体（缺失1个碱基）；若出现小658Da的峰，说明存在n-2截短体。质谱的优势是可精准识别缺失碱基的数量，且检测限低（可检出0.1%以下的杂质），适合对纯度要求极高的siRNA（如用于临床前研究）进行QC。

    siRNA合成产物的碱基缺失主要源于合成循环异常（偶联效率低、封端失效）、原料质量缺陷、后处理断裂，需从源头控制合成参数与原料纯度；而通过“合成中DMT监测预警→纯化前PAGE/CE快速定性→纯化后HPLC/质谱精准定量”的三级QC体系，可提前发现碱基缺失问题，确保最终产物纯度符合实验需求，避免因杂质影响RNA干扰效率或实验重复性。