表面等离子共振技术实验步骤

    表面等离子共振（SPR）技术的核心实验步骤围绕芯片预处理、配体固定、系统平衡、样品结合与解离、数据采集分析、芯片再生展开，全程依托SPR生物传感器完成，需严格控制温度、流速、缓冲液体系等实验条件，保证分子间相互作用检测的准确性和重复性，通用型经典实验步骤（以最常用的氨基偶联法固定配体为例，适配多数小分子、蛋白、抗体类配体）如下：

 

一、实验前准备与系统调试

    提前将SPR生物传感器开机预热，校准仪器光路、流速模块，设置实验核心参数：检测温度（常规25℃，可根据实验需求调整为37℃）、运行流速（常规10-30μL/min，小分子互作可适当降低，蛋白复合物互作可适度提高）、检测通道（空白通道做参比，样品通道做检测，消除非特异性结合干扰）。

    配制并预处理实验所需缓冲液：包括运行缓冲液（核心为PBS，根据分子特性添加0.005%-0.05%Tween-20、1-5%DMSO或10-50mMEDTA，用于维持分子构象、降低非特异性结合）、活化缓冲液、偶联缓冲液、封闭缓冲液、再生缓冲液，所有缓冲液均需经0.22μm滤膜真空抽滤除杂、超声脱气（避免气泡堵塞芯片流路、干扰SPR信号），并置于4℃冷藏备用；同时将配体、分析物（待测样品）用运行缓冲液稀释至预设浓度，室温平衡。

    取出SPR传感芯片（如CM5羧基芯片，氨基偶联法专用），检查芯片表面无划痕、污染后，安装至仪器芯片卡槽，确保卡槽密封、流路连接通畅。

 

二、传感芯片预处理与配体固定

    配体固定是SPR实验的关键，氨基偶联法为通用型固定方式，利用芯片表面的羧基与配体分子的氨基发生共价结合，固定效果稳定，适用于含游离氨基的生物分子；若配体为巯基、生物素化分子，可更换对应芯片和偶联方法，步骤略有调整。

    芯片表面活化：向样品通道注入活化缓冲液（如NHS/EDC混合液，N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺，摩尔比1:1），流速10μL/min，活化时间60-120s，使芯片表面的羧基活化为活泼的酯基，为与配体氨基结合做准备；空白通道同步注入运行缓冲液，保持相同流速。

    配体共价偶联：将配制好的配体溶液（用偶联缓冲液稀释，pH调至4.0-5.5，促进氨基与活化酯基结合）以10-20μL/min的流速注入样品通道，偶联时间根据目标固定量调整（常规10-30min，蛋白类配体目标固定量通常为500-2000RU，小分子配体可适当降低），通过仪器实时监测SPR信号，直至固定量达到预设值，停止注入配体。

    未结合位点封闭：向样品通道注入封闭缓冲液（如1M乙醇胺-HCl，pH8.5），流速10μL/min，封闭时间60-120s，中和芯片表面未与配体结合的活化酯基，防止后续分析物的非特异性结合，封闭完成后，用运行缓冲液冲洗通道至SPR信号基线稳定（基线漂移＜0.1RU/min）。

 

三、系统平衡与基线采集

    以实验预设流速持续向样品通道和空白通道注入运行缓冲液，平衡时间10-20min，直至两个通道的SPR信号基线均保持稳定，无明显漂移；随后采集基线信号（记为初始基线），作为后续结合反应的信号参照，空白通道的基线用于扣除样品通道的非特异性结合、缓冲液折射率差异等背景干扰。

四、分析物的结合与解离反应检测

    该步骤用于检测配体与分析物的实时相互作用，通过SPR信号的变化反映分子结合的动力学过程，可单次检测单浓度分析物，也可梯度浓度检测以获得动力学参数。

    结合相检测：将稀释好的分析物溶液（单浓度或系列梯度浓度，如0.1、0.5、1、5、10μM）以实验流速注入样品通道，注入体积根据流速调整（确保分析物与配体充分接触，常规接触时间60-300s），同时关闭空白通道的样品注入，仅通运行缓冲液；仪器实时记录SPR信号变化，信号随分析物与配体的结合逐渐上升，形成结合曲线，结合相结束时记录最大结合信号（RU值）。

    解离相检测：分析物注入完成后，立即切换为运行缓冲液，以相同流速持续冲洗样品通道，解离时间120-600s，仪器继续实时记录SPR信号变化；随着结合的分析物与配体解离，SPR信号逐渐下降，形成解离曲线，解离相结束时，信号应趋于平稳（若为不可逆结合，信号下降不明显）。

    梯度浓度重复检测：若需测定配体与分析物的动力学参数（结合常数k_on、解离常数k_off、平衡解离常数K_D），需对系列梯度浓度的分析物依次进行上述“结合-解离”检测，每完成一个浓度的检测，需用运行缓冲液冲洗通道至基线稳定后，再进行下一个浓度的检测，且所有浓度检测需保证实验条件一致。

 

五、传感芯片的再生与验证

    单次检测完成后，芯片表面仍残留未解离的分析物，需进行再生处理，使芯片表面恢复至初始状态，可重复用于后续检测（同批次或不同批次实验）。

    芯片再生：向样品通道注入再生缓冲液（根据分子间相互作用强度选择，如低pH缓冲液0.01MHCl、高盐缓冲液1MNaCl，或温和的变性剂，避免使用强变性剂破坏配体构象），流速10-20μL/min，再生时间30-60s，随后用运行缓冲液冲洗通道至SPR信号基线恢复至初始基线水平（漂移＜0.5RU/min），即完成再生。

    再生效果验证：若需重复使用芯片，可再次注入低浓度分析物进行小体积结合检测，若SPR信号无明显上升，说明芯片表面配体活性未受影响，再生效果合格；若信号异常，需调整再生缓冲液浓度或再生时间，或更换芯片。

 

六、实验后清洗与仪器关机

    完成所有样品检测后，用运行缓冲液以30μL/min的流速冲洗所有通道10-15min，彻底清除流路内的残留样品和试剂；随后取出传感芯片，若芯片需保存，用超纯水冲洗表面后，氮气吹干，置于干燥、避光的4℃环境保存；最后按照仪器操作规范，关闭SPR生物传感器的光路、泵体、温控模块，完成仪器关机。

 

七、数据采集与分析

    原始数据预处理：通过SPR仪器配套分析软件，将样品通道的原始信号扣除空白通道的背景信号，消除非特异性结合、缓冲液折射率、仪器噪音等干扰，获得校正后的SPR信号曲线。

    动力学参数拟合：对梯度浓度分析物的“结合-解离”校正曲线，采用软件内置的动力学模型（如1:1结合模型、双位点结合模型，根据分子互作特性选择）进行拟合，计算得到结合速率常数k_on、解离速率常数k_off，并通过公式K_D=k_off/k_on计算出平衡解离常数（K_D值越小，说明分子间相互作用越强，亲和力越高）。

    稳态结合分析：若分子结合达到稳态，可通过稳态结合曲线拟合，获得稳态解离常数K_D，同时可计算最大结合容量R_max、结合效率等参数。

    数据结果验证：对同一样品进行3次平行检测，计算数据的变异系数（CV＜10%为合格），确保实验结果的重复性和可靠性，最终整理成动力学参数报告和SPR信号曲线图。

 

八、注意事项

    全程保证实验环境清洁，避免灰尘、杂蛋白污染芯片和试剂；

    所有液体操作均需避免气泡，气泡会导致SPR信号骤降，干扰检测；

    配体固定量需适中，过高易导致空间位阻，过低易导致结合信号过弱，均会影响动力学参数拟合；

    再生缓冲液的选择需兼顾再生效果和配体活性，避免过度再生导致配体脱落或构象改变。