定点突变服务技术的操作过程

    定点突变服务的核心操作过程围绕目的基因获取、突变引物设计、突变体DNA扩增、野生型模板去除、突变体转化与筛选、阳性克隆鉴定及测序验证展开，主流采用PCR介导的定点突变法（含快速定点突变、重叠延伸PCR突变，前者适配单一位点/少量位点突变，后者适配多位点/片段突变），是目前技术成熟、效率最高的方法，全程需严格把控引物特异性、PCR扩增条件和模板去除效率，确保突变精准性，通用标准化操作过程（以最常用的快速定点突变法为例，适配质粒载体上的基因定点突变，也是服务端主流采用的方法）如下：

 

一、实验前准备与突变方案设计

    需求对接与模板确认：与客户确认突变需求，包括目的基因载体（质粒/菌液，如pET、pUC、pcDNA系列）、突变位点（单碱基替换/插入/缺失、多碱基突变）、突变类型（同义/错义突变、移码突变等），同时验证模板质粒的完整性，通过菌液PCR、质粒抽提和酶切鉴定，确认目的基因无缺失、无突变，且载体有合适的扩增与筛选标记（如氨苄青霉素、卡那霉素抗性）。

    突变引物精准设计：这是定点突变的核心关键，引物设计直接决定突变成功率，需遵循专属设计原则：突变位点位于引物中间区域（通常第8-15位），保证引物与模板的两端充分互补，提升结合特异性；

    引物长度为25-40bp，GC含量40%-60%，Tm值≥78℃（快速突变酶的适配要求），避免引物二聚体和发卡结构；

    若为碱基插入/缺失，在引物对应位置加入/删除碱基，保持引物整体互补性；

    上下游引物反向互补，覆盖同一突变位点，可同时作为PCR的正向和反向引物。
设计完成后进行引物合成与纯化（HPLC纯化，提升引物纯度），配制成合适浓度的引物溶液备用。

    试剂与耗材准备：选用高保真定点突变专用DNA聚合酶（自带3’→5’核酸外切酶校正活性，降低非特异性突变）、dNTP混合液、突变专用缓冲液、DpnⅠ限制性内切酶（识别甲基化DNA，仅切割野生型模板）、感受态细胞（如DH5α、TOP10，高效化感受态，转化效率≥10^8cfu/μg）、抗性培养基（根据载体抗性配置），所有耗材经无菌处理，避免核酸酶污染。

 

二、野生型模板质粒的抽提与纯化

    从客户提供的阳性菌液（或实验室保藏菌液）中，采用质粒小提试剂盒抽提野生型模板质粒，步骤为：菌液离心收集菌体→重悬菌体→加入裂解液裂解细胞→中和液沉淀蛋白与基因组DNA→离心取上清→过核酸纯化柱→洗涤去除杂质→洗脱获得质粒DNA。

    抽提后通过**核酸定量仪（NanoDrop）**测定质粒浓度和纯度（A260/A280=1.8-2.0为纯质粒），同时通过1%琼脂糖凝胶电泳验证质粒的完整性，无降解、无杂带，调整质粒浓度至实验所需（通常50-100ng/μL）备用。

 

三、PCR介导的突变体DNA扩增

    以野生型质粒为模板，通过PCR扩增全长突变体质粒DNA，此步骤为快速定点突变的核心，区别于常规PCR的片段扩增，全程为环状质粒的线性扩增，操作如下：

    配制PCR反应体系（25μL/50μL体系，根据实验需求调整）：依次加入无菌超纯水、突变专用缓冲液、dNTP混合液、上下游突变引物、野生型模板质粒、定点突变专用DNA聚合酶，轻轻混匀后短暂离心，避免气泡。

设置PCR扩增程序（适配专用聚合酶，标准化程序）：

    预变性：95℃30s（使质粒模板完全解链）；

    循环扩增：95℃10s（变性）→60℃30s（退火，引物与模板结合）→68℃延伸（延伸时间根据质粒长度调整，通常1kb/min，如5kb质粒延伸5min），共25-30个循环；

    终延伸：68℃5-10min（确保扩增产物完整）；

    保温：4℃保存。

    扩增过程中严格控制退火温度和延伸时间，避免非特异性扩增和扩增不完整。
PCR产物验证：取5μLPCR扩增产物，进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察是否出现单一、明亮的目的条带（条带大小与模板质粒一致），无杂带则说明扩增成功，可进行后续步骤；若出现杂带，需调整PCR条件（如提高退火温度、减少循环数）重新扩增。

四、DpnⅠ酶切去除野生型甲基化模板

    这是快速定点突变的关键创新步骤，也是保证突变体纯度的核心，操作如下：

    向剩余的PCR扩增产物中，加入1-2UDpnⅠ限制性内切酶（根据体系体积调整），轻轻混匀后短暂离心；

    将反应体系置于37℃恒温水浴中酶切1-2h，若质粒模板为高拷贝，可延长至3h，确保酶切完全；

    酶切完成后，将体系置于80℃水浴中灭活10min，终止DpnⅠ酶活，避免酶切后续突变体DNA。

    原理：野生型模板质粒来自大肠杆菌，DNA均为甲基化修饰，DpnⅠ可特异性识别并切割甲基化的GATC序列；而PCR扩增的突变体DNA为体外合成，无甲基化修饰，可完全避开DpnⅠ酶切，从而实现野生型模板的特异性去除，仅保留突变体DNA。

 

五、突变体DNA的环化与感受态细胞转化

    PCR扩增的突变体DNA为线性化质粒，需通过DNA聚合酶的延伸活性实现自连环化，再转化至感受态细胞中进行克隆扩增，操作如下：

    突变体DNA环化：利用定点突变专用聚合酶的5’→3’DNA聚合酶活性和链置换活性，PCR扩增的线性产物两端可自行互补配对，在酶的作用下完成缺口修复和环化，无需额外加入连接酶（快速突变法的优势，简化步骤）；若为特殊载体，可加入T4DNA连接酶进行辅助连接（16℃连接30min-1h）。

    感受态细胞转化：取5-10μL环化后的突变体DNA，加入100μL冰浴的高效化感受态细胞（DH5α/TOP10）中，冰浴30min，使DNA吸附于细胞表面；随后进行热激处理（42℃水浴热激30-60s，严格控制时间），快速置于冰浴中冷却2-3min，减少细胞死亡；向体系中加入800μL无抗性的LB液体培养基，37℃、200rpm摇床复苏1h，使细胞恢复正常生长并表达载体抗性基因。

 

六、转化菌的涂板筛选与单克隆挑取

    通过载体的抗性标记，筛选出成功导入突变体质粒的阳性菌落，操作如下：

    涂板培养：取100-200μL复苏后的菌液，均匀涂布于含对应抗性的LB固体培养基上（如氨苄青霉素抗性，终浓度100μg/mL），置于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h，直至培养基上长出单菌落。

    单克隆挑取：观察培养基上的菌落生长情况，挑取形态规则、大小均匀、无杂菌的单菌落（通常挑取5-10个，提高阳性率），分别接种至5mL含相同抗性的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床振荡培养12-16h，获得菌液培养物，备用。

 

七、阳性克隆的鉴定与测序验证

    这是确认突变是否精准实现的最终环节，需通过菌液PCR初筛+质粒酶切鉴定+DNA测序验证，层层筛选，确保无错配、无缺失、无非特异性突变，操作如下：

    菌液PCR初筛：以培养后的菌液为模板，加入目的基因的通用引物（非突变引物）进行PCR扩增，电泳检测是否出现目的条带，有条带则说明菌液中含有重组质粒，为候选阳性克隆，筛除无条带的阴性克隆。

    质粒抽提与酶切鉴定：对候选阳性克隆的菌液，采用质粒小提试剂盒抽提质粒，根据突变位点的特性，选择合适的限制性内切酶进行酶切（若突变引入/消除了酶切位点，酶切后条带大小会发生特征性变化），通过琼脂糖凝胶电泳验证酶切产物条带，与预期大小一致则为疑似阳性突变克隆。

    DNA测序验证（金标准）：将疑似阳性克隆的质粒送测序，测序引物选用目的基因的特异性引物（覆盖突变位点）或载体的通用引物（如T7、M13引物），获得测序峰图和序列后，与野生型序列进行比对分析：

    若突变位点的碱基与客户需求完全一致，且无其他非特异性突变（如随机碱基替换、缺失），则为阳性突变克隆；

    若出现突变位点不符或非特异性突变，需重新挑取克隆测序，直至获得完全符合需求的阳性克隆。

 

八、突变体菌株/质粒的保藏与交付

    阳性克隆保藏：将经测序验证的阳性突变克隆，制备甘油菌（菌液与50%甘油按1:1体积混合，终甘油浓度20%），置于-80℃超低温冰箱长期保藏；同时抽提大量高纯度的突变体质粒，分装后-20℃保存，避免反复冻融。

    服务交付：向客户交付阳性突变甘油菌（1-2管）、高纯度突变体质粒（1-2管，附浓度与纯度检测数据），同时提供完整的技术服务报告，包括：突变引物序列、PCR扩增条件、DpnⅠ酶切条件、转化与筛选结果、菌液PCR/酶切鉴定图谱、DNA测序峰图与序列比对结果，明确标注突变位点的精准性，确保实验结果可追溯。

 

补充：重叠延伸PCR定点突变（适配多位点/片段突变）

    若客户需求为多个不连续突变位点或基因片段的定点突变，则采用重叠延伸PCR法，核心步骤为：

    设计两对含突变位点的重叠引物，分别扩增含突变位点的两个DNA片段；

    将两个扩增片段混合，利用重叠区域的互补性进行退火，形成杂合链；

    加入外侧通用引物，扩增获得全长突变体DNA；

    将突变体DNA酶切后连接至载体，后续转化、筛选、测序验证步骤与快速定点突变法一致。

 

核心质控要点

    引物设计：严格遵循突变位点居中、高Tm值、无二级结构原则，合成后HPLC纯化；

    PCR扩增：使用高保真突变专用酶，严格控制循环数和延伸时间，避免非特异性扩增；

    模板去除：DpnⅠ酶切需完全，否则野生型模板会干扰筛选，降低突变成功率；

    测序验证：必须对突变位点区域进行精准测序，确保无任何非特异性突变，这是定点突变服务的核心交付标准。