重链抗体细菌表达
重链抗体是一种特殊类型的抗体,其通过单链抗体(scFv)产生,包含一个重链和一个轻链可变片段。与传统抗体不同的是,重链抗体只包含一个完整的抗原结合区域,而不含有Fc部分。
相较于传统抗体,重链抗体具有较小的大小,更好地渗透性和更高的稳定性,因此在药物研发中被广泛应用。重链抗体的表达通常采用细菌表达系统,下面将详细介绍在细菌表达系统中重链抗体的表达过程。
1、选择宿主菌
在重链抗体的表达中,E.coli是最常用的宿主菌之一,因为其具有易于生长、遗传学和生化学方面的研究工具,并且处理大量重组蛋白质也非常方便。通常情况下,选择BL21(DE3)或BLR等Strain作为表达宿主菌。
2、构建表达质粒
在表达系统中,需要构建表达载体来实现重链抗体的表达。基本的表达质粒包括启动子、选择标记、多克隆位点和终止子等元素。
启动子是控制转录的DNA序列,选择标记用于筛选正常重链抗体表达菌株,多克隆位点用于插入目标DNA序列并检测表达蛋白,终止子指定RNA链的终止位置和释放转录产物的DNA序列。
3、转化细胞
将构建好的表达质粒转化到宿主菌中。一般采用化学方法(如CaCl2法)或电穿孔法(如电转化法)将DNA转化为细胞中。转染后可通过筛选培养基,比如含有抗性筛选剂的LB平板,来挑选正常的克隆。
4、诱导表达
在得到正常的表达菌之后,应该加入适当的感受态诱导剂来实现重链抗体的表达。IPTG是最常用的诱导剂之一,其作用是使宿主菌内的T7 RNA聚合酶被激活,从而促进外源基因的转录和翻译。
5、培养和收获
在添加感受态诱导剂之后,应该采用适当条件下的培养方法来获得重链抗体。通常情况下,重链抗体表达的最佳培养条件为37℃下的250rpm振荡培养。表达菌的质量、时间和温度等因素对表达效果有着重要的影响。
在培养结束后,菌液应该进行离心分离得到细胞沉淀。之后采取适当方法,如冰乙酸法或超声波法,对细胞沉淀进行裂解,并收集表达重链抗体的上清液。
6、纯化
纯化是确保重链抗体高效性和活性的关键环节。通常可以采用亲和层析法、离子交换层析法或分子筛层析法等方法进行纯化。
在细菌表达中,构建表达载体、转化细胞、诱导表达,培养和收获以及纯化都是必不可少的步骤。每一步的优化都能带来重链抗体表达效率和纯度的提高。
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