CoIP实验中，细胞裂解液的制备需要注意什么？

关键操作：

    裂解液配方：温和裂解液（如含 1% NP-40 或 Triton X-100）：保留蛋白互作，适用于胞内蛋白；

    强裂解液（如含 SDS）：破坏蛋白互作，不可用于 CoIP；

    蛋白酶抑制剂：必须添加（如 PMSF、Complete Cocktail），防止蛋白降解；

    裂解温度：冰上操作，避免高温导致蛋白变性或互作解离；

    细胞数量：哺乳动物细胞建议每样本使用 1×10⁷–5×10⁷个细胞，确保足够的蛋白丰度。

    在 CoIP（免疫共沉淀）实验中，细胞裂解液的制备是关键步骤，直接影响蛋白互作的保留、非特异性结合水平及后续实验结果。以下是制备细胞裂解液时需注意的核心要点，分维度详细说明：

一、裂解液配方的选择

1. 表面活性剂（去污剂）的强度

    温和型裂解液（推荐用于 CoIP）：

        成分：含非离子型去污剂（如 1% NP-40、Triton X-100）或两性离子去污剂（如 CHAPS）。

        特点：破坏细胞膜但保留蛋白 - 蛋白互作，适用于胞内可溶性蛋白、核蛋白或中等强度互作的检测。

        配方示例：

        50 mM Tris-HCl (pH 7.4),  

        150 mM NaCl,  

        1% NP-40,  

        1 mM EDTA,  

        蛋白酶抑制剂（如PMSF、Complete Cocktail）。  

    强裂解液（禁用）：

        成分：含阴离子去污剂（如 SDS、Triton X-100 高浓度）。

        风险：破坏蛋白空间结构及互作界面，导致 CoIP 失败。

2. 盐浓度的调节

    标准盐浓度：100–150 mM NaCl（维持离子强度，减少非特异性电荷吸附）。

    高盐优化：若背景高，可提高至 300 mM NaCl（增强洗涤严谨性，但可能破坏弱互作）。

    低盐场景：仅用于检测极弱互作（需搭配交联剂使用）。

 

二、保护蛋白活性与互作的关键试剂

1. 蛋白酶抑制剂

    必要性：必须添加，防止细胞裂解后蛋白酶降解靶蛋白及互作蛋白。

    组合方案：

        常规选择：1 mM PMSF（短效，需现加）+ 1× 蛋白酶抑制剂 cocktail（广谱，如 Roche Complete）。

        特殊样本：若检测磷酸化蛋白，需额外添加磷酸酶抑制剂（如 Na3VO4、β- 甘油磷酸钠）。

2. 交联剂（可选）

    适用场景：检测瞬时互作、弱互作或膜蛋白互作时，需用交联剂固定天然构象。

    常用试剂：

        甲醛（可逆交联）：终浓度 0.1–1%，室温作用 5–10 分钟，用甘氨酸淬灭。

        DSS（膜透性交联剂）：终浓度 0.5–2 mM，用于固定细胞表面蛋白互作

 

三、实验操作细节与温度控制

1. 细胞裂解的物理方法

    贴壁细胞：

        弃培养基后，用预冷 PBS 洗涤 2–3 次（去除血清蛋白干扰）；

        直接向培养皿中加入裂解液，冰上孵育 15–30 分钟，用细胞刮收集裂解物。
    悬浮细胞：

        离心收集细胞（1000 rpm，4℃，5 分钟），弃上清后用预冷 PBS 重悬洗涤；
        加入裂解液，冰上涡旋或轻柔吹打混匀，避免产生气泡（气泡可能导致蛋白变性）。

 

2. 低温操作全程控温

    温度要求：所有操作在 4℃或冰上进行，包括试剂配制、裂解、离心和后续孵育。

    原理：低温可抑制蛋白酶活性，减少蛋白降解，同时维持蛋白互作的天然状态。

 

3. 裂解物的离心条件

    目的：去除细胞碎片、细胞核及不溶性杂质，避免堵塞磁珠或影响后续结合效率。

    参数：12,000–14,000 rpm，4℃离心 15–20 分钟，取上清（即裂解液）进行后续实验。

 

四、样本标准化与质量控制

1. 蛋白浓度测定

    方法：使用 BCA 法或 Bradford 法测定上清液蛋白浓度，确保不同样本间上样量一致（推荐每 IP 反应使用 1–5 mg 总蛋白）。

    意义：若蛋白浓度过低，可能导致互作蛋白检测不到；浓度过高则增加非特异性结合风险。

2. Input 对照的制备

    操作：取 10% 裂解液作为 Input 样本，与 IP 样本同时进行 Western Blot 检测。

    作用：

        验证靶蛋白和互作蛋白在原始裂解液中的表达水平；

        排除因细胞处理或裂解效率差异导致的假阴性结果。

 

五、特殊样本的裂解优化

1. 难裂解细胞（如肿瘤细胞、干细胞）

    增强裂解手段：

        超声破碎（低功率，10–20 次脉冲，每次 1 秒，冰上操作）；

        冻融法（-80℃与 37℃交替冻融 2–3 次）。

    注意：超声或冻融可能破坏部分蛋白互作，需预实验验证。

2. 膜蛋白或核蛋白的裂解

    膜蛋白：使用含 0.5% CHAPS 的裂解液，或添加膜蛋白提取试剂（如 Thermo Mem-PER）。

    核蛋白：先通过低渗裂解分离细胞质与细胞核，再用核裂解液（如含 0.1% SDS）提取核蛋白。

 

六、常见问题与解决方案

问题	可能原因	解决策略
裂解液浑浊	细胞碎片未充分离心	提高离心转速（如 16,000 rpm）或延长离心时间
蛋白降解严重	蛋白酶抑制剂失效或未及时添加	新鲜配制抑制剂，裂解后立即冰浴
互作信号弱	裂解液破坏互作	更换更温和的裂解液（如降低 NP-40 浓度至 0.5%）
背景高	裂解液中杂质蛋白过多	预清除（用 Protein A/G 磁珠 + IgG 吸附杂蛋白）

七、关键操作流程图
    细胞收集 → 预冷PBS洗涤 → 加入温和裂解液（含抑制剂）→ 冰上裂解15–30分钟 →  离心（14,000 rpm, 4℃, 20分钟）→ 取上清测定蛋白浓度 → 预清除（可选）→ 进行IP实验  

    通过严格控制裂解液成分、低温操作及样本标准化，可最大程度保留蛋白互作并降低背景，确保 CoIP 实验的可靠性。如需进一步优化特定细胞类型或蛋白的裂解条件，可提供详细信息后针对性讨论！