CoIP实验中，如何避免抗体重链/轻链对Western Blot结果的干扰？

解决方案：

    选择去 IgG 二抗：使用针对抗体种属的 去 IgG HRP 二抗（如抗小鼠 IgG H&L（HRP），但预先吸附过小鼠 IgG）；

    分子量区分：若靶蛋白与抗体重链（~55 kDa）/ 轻链（~25 kDa）分子量差异大，可通过调整电泳分离范围避开；

    阴性对照验证：IgG 对照中出现的条带需排除为抗体链干扰。

 

一、抗体重链 / 轻链干扰的本质与表现形式

1.1 抗体重链 / 轻链的结构特征

    基本结构：

        抗体由两条重链（Heavy Chain, HC，约 50 kDa）和两条轻链（Light Chain, LC，约 25 kDa）通过二硫键连接组成。

        重链可分为 IgG、IgM、IgA 等类型，其中 CoIP 常用的 IgG 类抗体重链分子量约为 50-55 kDa（如小鼠 IgG1 重链 50 kDa，IgG2a 重链 55 kDa）。

        轻链分为 κ 型（25 kDa）和 λ 型（23 kDa），哺乳动物中 κ 型占主导（约 60%-70%）。

    电泳行为：在 SDS-PAGE（还原条件）中，抗体的二硫键被破坏，重链和轻链分离，分别呈现 50 kDa 和 25 kDa 的特征条带。

 

1.2 干扰产生的核心机制

    内源性抗体污染：

        细胞样本（如免疫细胞、肿瘤组织）中可能存在内源性免疫球蛋白（如 B 细胞分泌的 IgG），其重链 / 轻链会与 Protein A/G 磁珠非特异性结合，导致 WB 背景。

        案例：在免疫细胞（如 Splenocytes）的 CoIP 实验中，内源性小鼠 IgG 的重链（55 kDa）可能与抗小鼠 IgG 的二抗交叉反应，形成干扰条带。

    外源性抗体残留：
        一抗残留：IP 步骤中未充分洗涤的一抗（如小鼠 IgG 抗体）会与 WB 二抗（如抗小鼠 IgG-HRP）结合，在 50 kDa 和 25 kDa 位置产生强信号。

        二抗交叉反应：二抗（如抗小鼠 IgG）可能识别样本中其他物种的免疫球蛋白（如大鼠 IgG 的重链），引发非特异性结合。

    磁珠结合非特异性：

        Protein A/G 磁珠除与抗体 Fc 段结合外，还可能通过静电作用吸附样本中的杂蛋白（如血清中的白蛋白），部分杂蛋白分子量接近抗体重链 / 轻链，导致假阳性条带。

 

1.3 干扰在 WB 中的典型表现

    特征条带位置：

        重链干扰：50-55 kDa（与目标蛋白分子量接近时易混淆，如常见的 50 kDa 蛋白 p53、AKT）。

        轻链干扰：25 kDa（可能与小分子蛋白如 β-actin 的降解产物重叠）。

    对照组表现：

        阴性对照（IgG IP 组）：若使用小鼠 IgG 作为同型对照，其重链 / 轻链会在 50 kDa 和 25 kDa 处出现明显条带，可能掩盖真实互作蛋白的信号。

        Input 对照：通常无重链 / 轻链条带（除非样本中存在内源性抗体），但若 Input 未加 Loading Buffer 煮沸，可能因抗体未完全变性而残留高分子量复合物。

 

二、抗体重链 / 轻链干扰的系统性解决方案

2.1 实验设计阶段的预防策略

2.1.1 一抗物种与二抗的交叉匹配优化

    原则：避免二抗与样本中内源性抗体的物种来源重叠。

    推荐组合：  

样本来源	一抗物种	二抗选择	原理
小鼠细胞 / 组织	兔单抗 / 多抗	抗兔 IgG-HRP	小鼠内源性 IgG 不与抗兔二抗反应
人源细胞 / 组织	大鼠单抗	抗大鼠 IgG-HRP	人血清中无大鼠 IgG 交叉反应
混合物种样本	山羊多抗	抗山羊 IgG-HRP	减少与常见实验动物抗体的交叉反应

    禁忌组合：小鼠样本 + 小鼠一抗 + 抗小鼠二抗（易引发内源性 IgG 与一抗的双重干扰）。

 

2.1.2 选择片段化抗体或修饰型抗体

    Fab 片段抗体：

        结构：仅含抗原结合片段（Fab），去除 Fc 段，无法与 Protein A/G 磁珠结合。

        优势：完全消除 IP 过程中抗体残留对 WB 的干扰，适用于严格的互作验证（如临床样本检测）。

        局限性：成本较高，且部分厂商仅提供特定靶点的 Fab 片段抗体（如 Abcam 的某些产品线）。

    生物素标记抗体：

        操作流程：IP 使用生物素标记的一抗，通过链霉亲和素磁珠捕获，WB 时用 HRP 标记的链霉亲和素检测，避免二抗与抗体轻链 / 重链结合。

        注意事项：需确保生物素标记不影响抗体与抗原的结合活性，预实验需验证标记效率（如 ELISA 法）。

 

2.1.3 同型对照的合理选择

    错误做法：直接使用与一抗同物种的 IgG 作为阴性对照（如小鼠一抗用小鼠 IgG 对照），会引入相同的重链 / 轻链干扰。

    改进方案：

        种属交叉对照：若一抗为小鼠 IgG1，对照可选用大鼠 IgG2a（需确认样本中无大鼠源性抗体污染）。

        亚型特异性对照：使用同物种但不同亚型的抗体（如小鼠 IgG2b 对照小鼠 IgG1 一抗），减少 Fc 段结构相似性导致的干扰。

 

2.2 实验操作阶段的干扰消除技术

2.2.1 裂解液的预清除处理

    原理：通过 Protein A/G 磁珠预先吸附样本中的内源性抗体及杂蛋白，降低非特异性结合。

    操作步骤：

        细胞裂解液离心取上清后，加入 50 μL Protein A/G 磁珠（预先用 PBS 洗 3 次）；

        4℃旋转孵育 1 小时（或过夜），离心去除磁珠，取上清进行 IP 实验；

        优化点：若样本为小鼠来源，可在预清除液中加入 10 μg/mL 小鼠 IgG（封闭磁珠的 Fc 结合位点）。

    效果验证：预清除前后的裂解液进行 WB 检测，观察 50 kDa 和 25 kDa 条带强度是否显著降低。

 

2.2.2 IP 洗涤步骤的强化

    标准洗涤流程：

        IP 孵育完成后，用含 0.1% Tween-20 的 PBST 洗涤磁珠 5 次，每次 5 分钟，4℃旋转；

        最后一次洗涤后，用 1×PBS 快速漂洗一次（减少 Tween-20 残留对后续电泳的影响）。

    高严谨性洗涤方案：

        若背景仍高，可在洗涤液中加入 500 mM NaCl（增强离子强度）或 0.5% 脱氧胆酸钠（增加去污能力），但需注意高盐或强去污剂可能破坏弱互作。

 

2.2.3 抗体 - 磁珠复合物的封闭处理

    封闭剂选择：

        BSA 封闭：IP 完成后，向磁珠复合物中加入 5% BSA（用 PBS 配制），4℃孵育 30 分钟，封闭磁珠表面未结合的位点。

        非免疫 IgG 封闭：加入 10 μg/mL 与一抗同物种的非免疫 IgG，竞争磁珠的 Fc 受体结合位点。

    机制：通过空间位阻减少二抗与残留一抗的非特异性结合，尤其适用于多克隆抗体的 IP 实验。

 

2.3 电泳与 Western Blot 阶段的优化

2.3.1 SDS-PAGE 的参数调整

    提高上样量分辨率：

        使用 10%-12% 的分离胶（经典配方），可有效分离 50 kDa（重链）与常见目标蛋白（如 60 kDa 的 ERK）；

        对于轻链（25 kDa）与小分子蛋白的区分，可改用 15% 分离胶（如检测 18 kDa 的 Caspase-3 时）。

    延长电泳时间：

        在恒压条件下（如 80 V→120 V），将溴酚蓝前沿跑至胶底（约 2 小时），确保重链 / 轻链与目标蛋白充分分离。

 

2.3.2 二抗的特异性增强策略

    使用 Fab 片段二抗：

        二抗仅保留 Fab 段（识别一抗的抗原结合区域），去除 Fc 段，避免与样本中内源性抗体的 Fc 段交叉反应。

        供应商：Jackson ImmunoResearch 提供多种物种的 Fab 片段二抗（如 AffiniPure F (ab')₂ Fragment of Goat Anti-Mouse IgG (H+L)）。

    预吸附二抗：

        操作：将二抗与同物种 IgG 预先孵育（如 1 μg 二抗 + 10 μg 小鼠 IgG，室温 30 分钟），中和二抗中针对 Fc 段的抗体成分。

        适用场景：紧急情况下无 Fab 片段二抗时的替代方案。

 

2.3.3 化学发光检测的优化

    缩短曝光时间：

        抗体重链 / 轻链通常为高丰度蛋白，曝光 10-30 秒即可显影，而目标互作蛋白可能需更长曝光（如 1-5 分钟）。

        策略：先进行短时间曝光记录抗体干扰条带，再延长曝光检测目标蛋白，避免过度曝光导致信号重叠。

    使用近红外荧光检测：

        采用红外荧光二抗（如 IRDye 800CW 抗兔 IgG），通过 Odyssey 成像系统检测，利用荧光信号的特异性降低化学发光的背景干扰。

        优势：可同时检测重链 / 轻链（通道 1）和目标蛋白（通道 2），通过软件分离信号（如 LI-COR Odyssey 软件的双通道分析）。

 

2.4 分子生物学层面的高级解决方案

2.4.1 敲除内源性抗体基因

    适用模型：基因编辑细胞系（如 CRISPR-Cas9 敲除小鼠 B 细胞的 IgG 重链基因 IgH）。

    操作流程：

        设计靶向 IgH 恒定区的 sgRNA，转染至小鼠 B 细胞系（如 CH12.F3）；

        通过流式细胞术筛选 IgG 阴性克隆，验证内源性 IgG 表达缺失；

        在该细胞系中进行 CoIP 实验，彻底消除内源性抗体重链干扰。

    局限性：仅适用于可基因编辑的细胞系，且需耗费较长时间构建模型。

 

2.4.2 表位标签融合蛋白技术

    策略：将目标蛋白与表位标签（如 Flag、HA、Myc）融合表达，使用标签抗体进行 IP，避免内源性抗体干扰。

    优势：

        标签抗体（如兔抗 Flag）与样本中内源性抗体无交叉反应；

        可选择非 IgG 类型的抗体（如兔抗 Flag 的 IgM 型抗体），进一步减少重链干扰（IgM 重链分子量约 70 kDa，与 IgG 重链分离）。

    注意事项：标签需位于蛋白非功能域，避免影响蛋白互作（如将 Flag 标签添加至目标蛋白 C 端，预实验通过 CoIP-WB 验证互作效率）。

 

2.4.3 种属间抗体交叉回避

    跨物种 IP-WB 策略：

        IP 抗体：选择大鼠来源抗体（如抗小鼠蛋白的大鼠单抗）；

        WB 二抗：使用抗大鼠 IgG-HRP，避免与小鼠内源性 IgG 交叉反应。

    经典案例：在小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中研究蛋白互作时，采用大鼠抗小鼠 CD45 抗体进行 IP，WB 用抗大鼠 IgG 检测，成功排除小鼠 IgG 的重链干扰（图 1）。

 

三、不同干扰场景的针对性解决方案

3.1 场景一：内源性 IgG 高表达的样本（如脾细胞、血浆）

    核心问题：样本中存在大量 B 细胞分泌的 IgG（小鼠脾细胞中约 10% 细胞为浆细胞，分泌 IgG）。

    解决方案组合：

        预清除 + Fab 片段抗体：

            裂解液用 Protein G 磁珠预清除内源性 IgG；

            IP 使用兔抗目标蛋白的 Fab 片段抗体，避免与 Protein G 结合。

        同位素标记差异分析：

            用 SILAC 技术标记细胞（如轻链 Arg/Lys vs. 重链 Arg/Lys₆），将 IgG IP 组（含内源性 IgG 干扰）与目标抗体 IP 组进行质谱分析，通过同位素峰差异排除干扰蛋白。

 

3.2 场景二：一抗与目标蛋白分子量接近（如目标蛋白 55 kDa，小鼠 IgG 重链 55 kDa）

    核心问题：重链条带与目标蛋白条带重叠，无法通过电泳分离。

    解决方案组合：

        抗体亚型切换：换用小鼠 IgG1 抗体（重链 50 kDa），与目标蛋白 55 kDa 形成 5 kDa 分子量差异，可通过 10% SDS-PAGE 分离。

        化学交联 + 非还原电泳：

            用 DSS 交联剂固定蛋白互作，保持抗体 - 抗原复合物为完整 IgG（150 kDa）；

            进行非还原 SDS-PAGE（不添加 β- 巯基乙醇），使重链 / 轻链保持二硫键连接，迁移至 150 kDa 位置，与目标蛋白（55 kDa）完全分离。

 

3.3 场景三：二抗交叉反应导致的多物种样本干扰（如人 - 鼠嵌合细胞）

    核心问题：人细胞中表达的鼠源抗体（如嵌合抗体）与抗小鼠二抗结合，产生非特异性信号。

    解决方案组合：

        种属特异性二抗吸附：

            将抗小鼠二抗与人类 IgG 预孵育，中和二抗中针对人 IgG Fc 段的交叉反应抗体。

       单细胞 CoIP 技术：

            使用显微操作分离单细胞，裂解后直接进行 IP-WB，减少混合细胞中异源抗体的干扰（适用于稀有细胞研究，如循环肿瘤细胞）。

 

四、实验验证与结果分析的黄金标准

4.1 干扰排除的验证指标

    阴性对照的严格性：

        同型对照 IP 组的 WB 结果中，50 kDa 和 25 kDa 条带应显著低于目标抗体 IP 组（若使用 Fab 片段抗体，同型对照应无任何条带）。

    Input 与 IP 样本的分子量匹配：

        目标蛋白在 Input 中的条带位置应与 IP 样本中去除重链 / 轻链干扰后的条带位置一致（排除抗体片段污染导致的假阳性）。

 

4.2 结果呈现的规范表述

    干扰条带的标注：在 WB 图中用星号（★）标注抗体重链 / 轻链条带，并在图注中说明 “非特异性条带为 IgG 重链 / 轻链”。

    灰度分析的扣除方法：使用 ImageJ 软件对目标条带进行定量时，需在邻近区域（无条带处）设置背景值，扣除抗体干扰的信号强度。

 

五、总结：抗体重链 / 轻链干扰的 5 层防御体系

防御层级	策略类别	具体方法	适用阶段
第一层	抗体选择优化	种属交叉抗体、Fab 片段抗体、表位标签抗体	实验设计阶段
第二层	样本预处理	预清除、高严谨洗涤、封闭处理	实验操作阶段
第三层	电泳分离强化	梯度胶、非还原电泳、延长电泳时间	检测阶段
第四层	二抗特异性增强	Fab 片段二抗、预吸附二抗、近红外荧光检测	检测阶段
第五层	分子模型构建	基因敲除内源性抗体、跨物种细胞系	长期模型准备

    通过上述多层次策略的联合应用，可系统性解决抗体重链 / 轻链对 CoIP-Western Blot 的干扰问题。实际操作中需根据样本特性、抗体类型及实验室条件进行组合优化，必要时通过预实验对比不同方案的干扰水平（如设置预清除组 vs. 未预清除组的 WB 对照），确保实验结果的准确性与可重复性。对于高难度样本（如临床组织样本），建议采用 “Fab 片段抗体 + 近红外荧光检测” 的双重保险策略，最大限度提升数据质量。