酶促切割法进行siRNA合成的基本流程是什么？为何更适合制备siRNA文库？

    酶促切割法（以Dicer酶切为例）合成siRNA的基本流程，核心是通过RNA酶的特异性切割生成小片段干扰RNA，其流程和适合制备siRNA文库的原因如下：

一、酶促切割法（Dicer酶切）合成siRNA的基本流程

1、长双链RNA（dsRNA）制备

    首先通过体外转录或基因克隆表达，获得目标基因对应的长链dsRNA（通常200-500bp）。体外转录时，需以DNA模板（含T7/SP6启动子）合成正义链和反义链RNA，再退火形成dsRNA；若从克隆载体获取，可通过限制性酶切释放目的片段后转录生成dsRNA。

 

2、Dicer酶切反应

    将长链dsRNA与Dicer酶（一种RNAseIII家族酶，可识别dsRNA并切割产生21-23nt的siRNA，两端含2nt突出端）在优化的缓冲体系（含Mg²⁺、ATP等辅因子）中孵育（通常37℃，2-4小时）。Dicer酶通过识别dsRNA的二级结构，非特异性地将其切割为多个符合siRNA长度的小片段。

 

3、切割产物纯化与筛选

    酶切反应后，通过PAGE电泳或硅胶柱纯化，去除未切割的长链dsRNA、酶和缓冲液杂质，获得混合的siRNA群体。若需富集特定序列，可通过与目标mRNA杂交等方法筛选，但常规流程中多保留混合产物用于后续实验。

 

4、活性验证

    通过转染细胞后检测目标基因的沉默效率（如qPCR检测mRNA水平、Westernblot检测蛋白水平），验证酶切产物的干扰活性，确保siRNA群体可有效抑制靶基因表达。

二、酶促切割法更适合制备siRNA文库的原因

    siRNA文库需覆盖大量基因或一个基因的多个靶位点，酶促切割法的特性使其在这一场景中具有显著优势：

1、高效覆盖靶序列

    Dicer酶切割长链dsRNA可产生针对同一基因的多种siRNA（覆盖不同靶位点），无需对每个siRNA进行单独设计和合成，能快速构建覆盖特定基因家族或全基因组的siRNA混合文库，大幅降低文库制备的工作量和成本。

 

2、避免序列偏好性

    化学合成siRNA需预先设计特定序列，可能因序列选择偏差（如GC含量过高、二级结构影响）导致部分siRNA活性低；而Dicer酶切生成的siRNA群体覆盖范围广，可减少因单个序列无效而导致的筛选失败，提高文库的实用性。

 

3、模拟体内RNA干扰机制

    体内siRNA主要通过Dicer酶切割pre-miRNA或长dsRNA产生，酶促切割法生成的siRNA结构（如2nt突出端）与体内天然siRNA一致，相比化学合成的部分修饰siRNA，更易被RNA诱导沉默复合体（RISC）识别，沉默效率更稳定，适合文库的功能筛选。

 

4、可扩展性强

    对于大规模文库（如全基因组siRNA文库），酶促切割法可通过批量制备长链dsRNA并酶切，实现标准化、规模化生产，而化学合成需逐个合成单条siRNA，成本高且流程繁琐。

 

    酶促切割法的高效性、广覆盖性和与体内机制的兼容性，使其成为制备siRNA文库（尤其是需要覆盖多基因或多靶位点的文库）的优选方法。