RIP技术如何破解RNA蛋白密码？

    你以为的RNA不稳定，易降解，只是DNA的“小弟”？其实不然，它可是细胞里的“社交达人”，可以和蛋白质组团搞事业、玩调控，在生命活动中发挥着重要的作用。

    但问题来了——如何实时捕捉它们的“亲密互动”？

    别慌！今天带你解锁科研圈的“特工神器”：RIP技术（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA结合蛋白免疫沉淀），一键揭开RNA-蛋白复合体的神秘面纱！

    RIP顾名思义就是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术。通过使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过WB实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。

图1. RIP实验原理图

 

一、RIP实验设计

01.根据实验目的选择合适的实验方式

    ❖ 验证与目标蛋白结合的已知 RNA：通过联合免疫共沉淀技术和 RT-qPCR 检测技术进行验证，明确蛋白与 RNA 的相互作用关系。

    ❖ 筛选与目标蛋白结合的未知 RNA：将 RIP 技术与高通量测序相结合，能够高通量地检测与特定蛋白结合的 RNA，从而解析全转录组范围内的目标蛋白 - RNA 相互作用网络

02.合理设计互补实验，双重验证（体内，体外实验双结合）

    ❖ EMSA可以用来在体外验证RNA和蛋白质的互作，

    ❖ RIP是体内研究RNA和蛋白互作

    将RIP和RNA-EMSA进行联合分析，相互验证这是经典研究策略，双重验证，更有说服力。

 

二、实验前准备 

（1）在正式实验前，务必要对样品做WB质控；

（2）IP前WB检测的指标应包括诱饵蛋白以及内参蛋白；

（3）内参蛋白条带必须清晰无拖带，如果内参条带不正常，说明样本内蛋白已经发生降解，需要重新备样；

（4）诱饵蛋白条带最好是强信号的单带，如果信号比较弱，IP后可能实验失败，建议在样本中过表达目的蛋白后再做尝试；

（5）诱饵蛋白WB如果杂带较多，可能是该批次抗体在该样本中的特异性不够好，如果实在没有合适的抗体，也至少应当在目的条带的信号相较于杂带足够强的前提下，再进行后续实验，否则无法保证最终结果的可靠性；

（6）IP前也应通过qPCR检测猎物RNA的本底表达水平，若表达水平太低，IP后可能检测不到导致假阴性结果。

 

三、RIP实验流程

（1）细胞收集和交联

培养和处理细胞，用甲醛等化学交联剂对细胞进行单交联或双交联，交联后可直接实验或在 - 80°C 保存。

（2）细胞裂解

制备裂解缓冲液，添加蛋白酶抑制剂和 RNA 酶抑制剂，收集细胞（约 1×10^⁷），用预冷PBS清洗2次。加入1 mL裂解缓冲液，冰上裂解30分钟，期间涡旋混匀数次。关键点：裂解液需温和，避免破坏RNA-蛋白复合物；全程保持低温（冰上操作）。

（3）抗体-磁珠复合物制备

1）准备2支1.5mL EP管，分别标记IgG管和IP管，将ProteinA/GMagnetic Beads原管上下颠倒10次，待磁珠和液体混匀后，分别取出30μL到IgG管和IP管；

2）每管加入300μL RIP Wash Buffer，用移液枪吹打混匀5次，置于磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作3次；

3）用300uL的RIP Wash Buffer重悬磁珠。

（4）磁珠结合抗体

1）IP管加入3-5μg目的抗体，lgG管加入3-5μg目的抗体相同宿主的lgG，放到静音混合器上室温孵育2h；

2）将两管放到磁力架上静置1min，弃上清；

3）加入300ul RIP Wash Buffer，用移液枪吹打混匀5次，在磁力架上静置1min，弃上清，该步骤操作3次。

（5）RNA结合蛋白免疫沉淀

1）准备 RIP Buffer；

2）向IgG管和IP管中分别加入900ul RIP Buffer，150uL Lysis，放到静音混合器上，4℃孵育过夜；磁力架分离磁珠，弃上清。用预冷裂解缓冲液洗涤磁珠5次（每次300μL），轻柔重悬避免损失

（6）RNA 纯化与分析

加入蛋白酶 K 去除蛋白质，进行 RNA 提取和定量，再通过 RT-qPCR 比较总输入样品和抗体富集 RNA 样品之间的富集程度，或进行文库准备和高通量测序。

图2. RIP实验流程

 

四、RIP实验结果解读

图3. RIP实验结果

1、一次完整严谨的RIP实验，应当包含IgG对照组、IP实验组以及Input组；

2、Input泳道所点样本与IP前WB一致，作为阳性对照；

3、判定RIP实验成功的标准，是能够在IP泳道检测到诱饵蛋白信号，且IgG泳道检测不到；如果IgG泳道也检测到诱饵蛋白，说明该蛋白能够与所有IgG类的抗体结合，只能换别的实验如RNA pulldown来验证。

4、通过qPCR检测猎物RNA，若IP组相比于IgG组有显著富集效果，说明诱饵蛋白和猎物RNA有互作。

 

五、主要应用

RNA-蛋白质互作研究

❖ 发现新型RNA结合蛋白：捕获特定RNA（mRNA、lncRNA、circRNA等）的相互作用蛋白，揭示未知调控网络。

❖ 验证已知互作：精准检测目标RNA与候选蛋白（如转录因子、酶）的物理结合，支撑机制研究非编码RNA功能解析和生物标志物挖掘。

❖ 筛选与疾病相关的RNA结合蛋白

❖ 病毒RNA宿主蛋白互作研究

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