双荧光素酶实验-从文献实例看核心应用方向

    双荧光素酶实验是一种基于荧光信号检测的报告基因分析技术，通过同时引入两种荧光素酶作为报告基因，实现对目标基因表达调控的精准量化。其中，萤火虫荧光素酶作为主要报告基因，其表达受待研究的启动子或调控元件驱动，反映目标序列的转录活性；而海肾荧光素酶作为内参报告基因，由组成型启动子控制表达，用于校正实验过程中的系统误差，如细胞转染效率差异、样本处理波动等。通过检测两种荧光素酶催化底物产生的特异性荧光强度，计算两者的比值，可有效消除干扰因素，获得更可靠的实验结果。

    这一技术凭借高灵敏度、良好的线性范围和实验重复性，被广泛应用于基因表达调控机制研究。为更清晰地呈现其核心价值，接下来将结合具体文献实例，从启动子活性分析、转录因子结合验证、miRNA 靶向调控研究等方向展开探讨，揭示双荧光素酶实验在分子生物学研究中的关键应用。

1、miRNA调控病毒复制的研究

    miR-196a通过双荧光素酶报告基因系统被证实能够直接靶向HCV基因组的NS5A区域，显著抑制HCV的复制。实验表明，过表达miR-196a的Huh 7.5细胞中，HCV基因组复制率显著降低，提示miR-196a可能成为一种新的抗病毒治疗策略[1]。类似地，发表在Cell Death Discov期刊上的一篇文章[2]，miR-124-3p通过靶向TRAF3基因，在肝细胞中调控炎症反应和细胞凋亡，这一机制也通过双荧光素酶报告基因系统得到验证（图1）。

图1. miR-124-3p 下调 TRAF3 的表达，从而抑制 H2O2 诱导的肝细胞凋亡和炎症因子的释放(图来源于[2])

2、癌症相关基因的调控机制

    在癌症研究中，双荧光素酶报告基因系统被用于验证miRNA与靶基因的相互作用。例如发表在《J Neuroinflammation》期刊上的一篇题为“Exosomal miR-409-3p secreted from activated mast cells promotes microglial migration, activation and neuroinflammation by targeting Nr4a2 to activate the NF-κB pathway”文章。主要探究外泌体 miRNA 是否参与肥大细胞和小胶质细胞之间的相互作用，从而介导神经炎症。

    为了鉴定 miR-409-3p 的候选靶基因，作者收集并交叉了三个预测软件程序（TargetScan、miRWalk 和 microT） 的输出。在 30 个交叉基因中，Nr4a2 的 3′-UTR 与 miR-409-3p 结合，得分高，保守性高（图2a）。接着通过荧光素酶报告基因验证miR-409-3p和Nr4a2基因的关系，发现相对于对照组，miR-409-3p 模拟物和 Nr4a2-WT 组的荧光素酶强度降低，这表明 Nr4a2 是 miR-409-3p 的直接靶标（图2b），此外，Western blot分析显示，高miR-409-3p水平下调Nr4a2蛋白表达并上调NF-κB蛋白表达（图 2c-d）,证实了miR-409-3p通过靶向Nr4a2基因激活NF-κB通路，促进神经炎症反应。

图2.miR-409-3p 通过靶向 Nr4a2 激活 NF-κB 通路，成为促神经炎症分子（图来源于[3]）

3、基因启动子活性的研究

    双荧光素酶报告基因系统还被用于研究基因启动子的活性及其变异对基因表达的影响。例如，发表在《Cell Rep Methods》期刊上的一篇题为“Atlas of primary cell-type-specific sequence models of gene expression and variant effects”文章，使用双荧光素酶报告基因系统实验测试了特征PTEN启动子的顶部 ClinVar变体的转录调节活性，发现该区域在神经母细胞瘤细胞中产生了强大的转录活性（图3B）. 预测影响最高的三个位置的替代等位基因降低了这种活性，而预测影响低的替代等位基因则没有。这表明PTEN启动子中的ClinVar变异对基因表达具有显著影响，特别是在神经母细胞瘤细胞中[4]。

图3.ExPectoSC 预测和实验证实的 ClinVar 变体在 PTEN 启动子中的细胞类型特异性作用(图来源于[4])

4、药物筛选与基因表达调控

    在药物筛选领域，双荧光素酶报告基因系统被用于评估药物对基因表达的调控作用。例如，针对AGAT基因表达的药物筛选研究中，作者应用稳定表达AGAT启动子和萤火虫荧光素酶报告基因的HeLa细胞系进行高内涵筛选和二次筛选。为了进一步评估，将Nanoluc荧光素酶作为报告基因整合到HAP1细胞系中的内源性AGAT基因中，并使用人类永生化细胞系RH30作为GAMT缺乏症的模型。尽管最终未找到有效的选择性抑制剂，但证明了该系统在药物筛选中的重要性[5]。

5、植物基因调控研究

    在植物研究中，双荧光素酶报告基因系统被用于验证转录因子对淀粉合成相关基因的调控作用。例如，HvAP2-18基因通过双荧光素酶报告基因系统被证实能够结合AGP-S和SBE1基因的启动子，从而调控大麦淀粉的合成[6]。

    还有最近发表在Plant Biotechnology Journal期刊上一篇题为“Regulation of jasmonic acid signalling in tomato coldstress response: Insights into the MYB15-LOXD andMYB15-MYC2-LOXD regulatory modules”的研究论文。该论文深入探索番茄在低温环境下的应对机制，揭示了植物激素脱落酸（ABA）和茉莉酸（JA）在其中的关键角色，为提高作物的抗寒能力提供了新的策略。为了进一步阐明SlMYC2在番茄耐寒性中的作用，通过双荧光素酶报告基因实验，发现与空载体对照相比，SlMYC2显著增加了用SlCBF1/2pro-LUC转化的烟叶中的报告蛋白 （LUC） 表达水平（图3c），表明SlMYC2可以与SlCBF1/2启动子结合，从而通过转录调节SlCBF1/2表达来调节番茄耐寒。

图4.SlMYC2 转录调节 SlCBF1/2 并参与番茄的耐寒性（图来源于[7]）

    双荧光素酶报告基因系统在基因表达调控研究中具有广泛的应用，特别是在miRNA与靶基因相互作用、启动子活性分析以及药物筛选等领域。这些研究不仅揭示了基因调控的分子机制，还为疾病治疗和药物开发提供了新的思路。未来，随着技术的进一步发展，双荧光素酶报告基因系统在基础研究和临床应用中将继续发挥重要作用。

参考文献：

[1] Shafaati M. et al. Downregulation of hepatitis C virus replication by miR-196a using lentiviral vectors. Microbiology and immunology. 2021

[2] Wang YL, Zhang Y, Cai DS. Hepatoprotective effects of sevoflurane against hepatic ischemia-reperfusion injury by regulating microRNA-124-3p-mediated TRAF3/CREB axis. Cell Death Discov. 2022 Mar 8;8(1):105. 

[3] Hu L, Si L, Dai X, Dong H, Ma Z, Sun Z, Li N, Sha H, Chen Y, Qian Y, Zhang Z. Exosomal miR-409-3p secreted from activated mast cells promotes microglial migration, activation and neuroinflammation by targeting Nr4a2 to activate the NF-κB pathway. J Neuroinflammation. 2021 Mar 9;18(1):68.

[4] Sokolova K, Theesfeld CL, Wong AK, Zhang Z, Dolinski K, Troyanskaya OG. Atlas of primary cell-type-specific sequence models of gene expression and variant effects. Cell Rep Methods. 2023 Sep 25;3(9):100580.

[5]Tkachyova I, Tropak MB, Lee A, Datti A, Ito S, Schulze A. Targeting AGAT gene expression - a drug screening approach for the treatment of GAMT deficiency. Expert Opin Drug Discov. 2024 Nov;19(11):1383-1397. 

[6]Ding J. et al. Re-examination of the APETALA2/Ethylene-Responsive Factor Gene Family in Barley ( Hordeum vulgare L.) Indicates a Role in the Regulation of Starch Synthesis. Frontiers in plant science. 2021

[7]Li W, Wen Y, Quan J, Gao M, Shang C, Liu X, Liu G, Hu X, Li J. Regulation of jasmonic acid signalling in tomato cold stress response: Insights into the MYB15-LOXD and MYB15-MYC2-LOXD regulatory modules. Plant Biotechnol J. 2025 Jun 30.