一文带你全方位解析ChIP技术

     染色质免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, ChIP） 作为解析DNA-蛋白质相互作用的经典方法，自1984年由Gilmour和Lis首次建立以来，已成为表观遗传学研究的关键技术。该技术通过抗原-抗体特异性结合原理，实现对目标蛋白（如转录因子、修饰组蛋白）及其结合基因组DNA片段的共沉淀，从而精确定位蛋白-DNA互作位点。在基因表达调控、表观遗传修饰图谱构建及疾病发生机制研究中，ChIP技术提供了不可替代的空间分辨率证据，为揭示真核生物转录调控网络奠定了方法论基础。

一、技术原理：ChIP如何“锁定”目标？

    我们可以把ChIP想象成为一场精密的“分子抓捕行动”：

    （1）交联：甲醛快速“冻结”细胞内DNA与蛋白质的相互作用；

    （2）片段化：超声波或酶将染色质“粉碎”成200-500bp小片段；

    （3）免疫沉淀：特异性抗体如“磁铁”般吸附目标蛋白及其结合的DNA片段；

    （4）解交联与纯化：释放DNA片段并纯化；

    （5）下游分析：qPCR或测序揭示蛋白质结合的DNA序列。

    （6）整个过程如同在浩瀚基因组中精准定位目标蛋白的“专属车位”！

图1. ChIP实验流程

二、主要应用场景

1、转录调控

    锁定转录因子（如p53, NF-κB）在启动子、增强子上的结合位点，揭示基因开关机制。

    例如：发现癌基因MYC的关键调控位点，助力靶向药物设计。

2、组蛋白修饰

    检测组蛋白修饰（H3K4me3激活标记，H3K27me3抑制标记），绘制表观遗传图谱。

    应用：干细胞多能性维持、细胞命运转变研究。

3、疾病机制

    追踪疾病中异常蛋白-DNA互作（如肿瘤中BRCA1结合异常），发现治疗新靶点。

    突破：揭示阿尔茨海默病中组蛋白修饰紊乱。

 

三、如何选择：ChIP-qPCR vs ChIP-seq

    当需要解析蛋白质与DNA的互作关系时，这两个技术该如何选择呢？我们先来看下两个实验的区别在哪里！

特性	ChIP-qPCR	ChIP-seq
检测范围	已知特定靶位点（如启动子）	全基因组无偏扫描
分辨率	单个位点精确定量	全基因组高分辨率图谱
通量	低（单次几个位点）	高（一次覆盖全基因组）
成本	低（无需测序）	高（依赖高通量测序）
适用阶段	验证候选区域/预实验优化	探索未知互作区域/全局分析

选择策略：

✅ 目标明确（如验证TF结合已知启动子）→ ChIP-qPCR

✅ 探索未知区域/绘制全基因组图谱 → ChIP-seq

 

四、实验成败关键点！

    样本制备：质量是试验成功与否的重要前提。

    动物组织：新鲜组织需要用PBS洗涤去除残留血液和污染物，迅速剥去脂肪和筋皮等结缔组织，冲洗干净；用组织剪或手术刀将组织分离成1cm3左右的小块，装入2mL或者更大体积的螺旋冻存管中，准确标记名称。

    植物组织：如果样品表面有泥土或明显污染物，先用PBS清洗，吸水纸吸去表面液体。

    样本量：哺乳动物细胞≥5×10⁶（注意：活率85%以上），组织根据实际情况进行样本准备，柔软组织3-5g即可，坚硬组织建议10g以上。

    交联时间：1%甲醛，室温10-15分钟（过长导致抗原遮蔽！）

    终止：甘氨酸至终浓度0.125M

    超声破碎：均匀片段化是核心，参考条件:18%或50W、ON 1S、OFF 1S，超声15min

    目标：获得合适得染色质片段，ChIP-qPCR片段集中在200-700 bp，ChIP-seq片段集中在300bp左右最佳

    抗体选择：选错抗体会导致实验失败，必选经ChIP验证的抗体（查看文献/官网数据），因为它能高特异性识别目的蛋白的立体表位，且在通过IP和洗涤步骤后仍然能够保持与目的蛋白的紧密结合。建议开展预实验（如Western或IP）验证抗体有效性

避免陷阱：

➤仅WB验证的抗体可能无效！

➤多克隆抗体需警惕批次差异

 

五、进阶攻略：多组学联合揭示全局调控

    当研究基因表达调控网络时，单一技术仅能捕捉分子事件的单一维度：

    ATAC-seq：鉴定染色质开放区域（潜在调控元件），但无法明确具体作用蛋白

    ChIP-seq：定位特定蛋白结合位点，但无法区分功能性结合与非功能性结合

    我们可以让ChIP+ATAC-seq强强联合，解锁更高维调控逻辑！

    ATAC-seq：先快速扫描全基因组开放染色质区域（潜在调控元件）

    ChIP精准定位：在开放区域锁定特定TF或组蛋白修饰

整合分析：

    ① 重叠ChIP峰与ATAC峰→验证功能性结合位点

    ② 关联RNA-seq数据→建立“染色质开放-蛋白结合-基因表达”因果链

 

六、常见问答

1.抗体的需要用量？需要准备多少抗体？

    在ChIP实验中，一个免疫沉淀反应使用5μg左右的抗体量，具体用量需要通过摸索调试，若效价不佳可能需增加到10μg左右，因此做一个样本需要准备的抗体量至少应＞10μg或10μL。

2.染色质片段大小在哪个范围比较合适？

    对于ChIP-seq，片段在200-500bp左右是最合适范围；对于ChIP-qPCR，片段在200-800 bp左右适宜。

3.ChIP实验植物样本处理和动物组织/细胞有何区别？

    植物组织由于细胞壁、气腔等结构的存在，会给交联缓冲液的作用带来困难，因此相对于动物组织/细胞来说，往往需要在抽真空条件下进行交联，而该步骤是一个需要经验及优化的过程。

4.ChIP实验如何设置对照及重复？

    通常ChIP过程产生3份DNA产物，Input、IgG产物、IP产物。Input是染色质片段化后提取获得的总DNA、未经抗体加入免疫沉淀过程，IgG组这是用实验抗体的同型阴性对照抗体、作为mock IP，IP产物即是以实验抗体获得的免疫沉淀产物。

    在后续的qPCR检测中，通常将IgG产物组作为IP产物组的对照。如需设置阳性对照抗体，可以选择Histone H3或者RNA polymerase II，然后以GAPDH或Actin等作为检测基因。

    在后续的Sequence中，通常将Input组产物作为测序对照样品。

5.我们ChIP-qPCR中对于一个基因启动子设计多少引物？

    如果未能确定启动子上的具体结合位点，则需要对启动子的-2k范围设计qPCR引物，建议至少设计3对引物，有时存在特殊性的启动子可能会增加到4对引物。引物设计过程是：找到已经研究确认的被调控基因、或本实验中欲验证的基因，选择其启动子区域（一般从转录起始位点上溯到-2k），以该序列为模板设计qPCR引物，如研究的转录因子具有特定的结合序列motif，则可着重在这些motif附近设计引物。

6.ChIP-Seq中的测序DNA样本需要多少产量？

    通常是≥10ng。随着目前建库技术的不断完善，低至5ng的DNA量也能被建库成功；少数测序公司为了降低自身风险提出20ng的要求，通过可以协商降低该送样要求。尤其是一些转录因子，最终能够捕获的DNA量会很低。

7.我所研究的蛋白难以找到ChIP级抗体怎么办？

    较常用的方式可以将目的蛋白同某种标签融合表达，比如HA、GFP、Myc等标签，使用这些标签抗体的ChIP级抗体，这种途径也常见于发表文献中。

8.ChIP风险如何判断？

    ChIP实验以标签来判断实验风险，重组标签的转录因子＞内源转录因子＞组蛋白；当以重组蛋白作为靶蛋白时，重组蛋白同内源蛋白可能存在结合活性、结合位点差异；以标签抗体进行ChIP时、染色质结合位点本身会被内源蛋白竞争，这些都会影响到ChIP过程的特异性捕获效率。