RNA pull down技术实验的应用场景

    在细胞这个 “万亿级精密工厂” 里，每天都上演着无数 “暗箱操作”—RNA 作为穿梭于细胞核与细胞质的 “信使”，总在悄悄拉拢蛋白质 “盟友”，共同联手达到调控基因表达的目的。想知道这些 “RNA” 如何接头？如何锁定关键 “蛋白分子”？今天就给大家聊聊科研界追踪 RNA -蛋白互作的 “GPS系统”—— RNA pull down 技术！
 

01.什么是 RNA pull down？

    RNA pull down 技术主要是用来捕获特定RNA的相互作用蛋白。简单来说，这是一场 “反向钓鱼” 实验：

1.先人工合成一段 “目标 RNA 探针”（你的 “钓鱼诱饵”），并给它贴个“专属标签”（生物素标记）；

2. 把标记好的 RNA 放进细胞裂解液中，等待与之互作的蛋白质 “猎物”自动上钩；

3. 用 “磁珠捕手”（链霉亲和素磁珠）精准捕获 RNA - 蛋白复合物，若待检测目的蛋白明确，通过WB实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用！若不明确，则可选择质谱鉴定。

RNA pull down 原理图

 

02.实验前期准备：科学规划是成功基石

1. 样本选择与处理

细胞或组织样本：需确保RNA完整性与纯度，避免反复冻融。

RNA探针设计：针对目标RNA设计生物素标记的互补探针，需避开二级结构区域。

阴性对照：设置无关序列探针或未标记探针组，排除非特异性结合干扰。

 

2. 试剂与设备清单

核心试剂：生物素标记探针、链霉亲和素磁珠、RNase抑制剂、裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）。

仪器准备：磁力架、恒温混匀仪、低温离心机、Western Blot或质谱检测设备。

耗材预冷：全程使用RNase-free枪头、EP管及冰盒操作。

 

03.方法选择-转录法 or 探针法?

 

特别短的诱饵比如在60bp以下，可以直接合成带标记的诱饵RNA本体。

探针法和转录法原理上的不同，决定了转录法的特异性和结果的可靠性都要强于探针法，因为合成的RNA探针不能太长，这导致探针可能会非特异性的结合到其他的非诱饵RNA上，最终富集出的猎物也可能不是我们诱饵RNA所特异性结合的。

 

04.实验步骤：标准化流程保障结果可靠性

1.RNA标记：首先，标记目标RNA分子（通常是合成的in vitro转录RNA），通常使用生物素（biotin）标记。这种标记的RNA片段可以被用作“鱼饵”来捕获与其相互作用的蛋白质。

2.RNA与细胞提取物相互作用：标记的RNA片段被加入细胞或组织的提取物中，使其和与之相互作用的蛋白质结合形成RNA-蛋白质复合物。

3.亲和富集：标记的RNA片段及其相互作用的蛋白质复合物可以通过生物素和亲和纤维素（如琼脂糖琼脂糖珠）的相互作用来富集。这种亲和富集的步骤将RNA-蛋白质复合物从总提取物中分离出来。

4.洗涤： 富集的RNA-蛋白质复合物被多次洗涤，以去除非特异性结合的蛋白质和其他污染物。

5.蛋白质识别： 最后，富集的蛋白质可以通过质谱分析、WB等技术来鉴定和分析。
 

05.应用场景：解锁RNA研究的更多可能

❖发现新型RNA结合蛋白：捕获特定RNA（mRNA、lncRNA、circRNA等）的相互作用蛋白，揭示未知调控网络。

❖验证已知互作：精准检测目标RNA与候选蛋白（如转录因子、酶）的物理结合，支撑机制研究

❖病毒-宿主互作：追踪病毒RNA劫持宿主蛋白的关键靶点。

❖药物靶点筛选：基于RNA-蛋白复合物设计小分子抑制剂。
 

06.注意事项：避开这些“坑”，效率翻倍！

➤ 严格控污：全程佩戴手套，使用DEPC水处理耗材，杜绝RNase污染。

➤ 温度敏感：裂解和洗脱步骤需精确控温，避免RNA降解或蛋白失活。

➤ 磁珠处理：洗涤时避免磁珠干涸，每次需充分重悬。

➤ 数据验证：建议结合RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀）技术交叉验证结果。

RNA pull down实验在生命科学研究中发挥着重要的作用，为解决更多生物学难题提供了强有力的技术支撑。武汉金开瑞能够提供包括RNA pull down 、RIP、EMSA、双荧光素酶等技术服务，从方案流程设计到技术试验执行，从科研技术服务到成品试剂盒提供，金开瑞实验平台满足您的一切需求，期待与您一起携手合作。

 

QA：常见问题

1.实验全程如何预防RNA降解?

实验使⽤的所有试剂耗材需经过去RNA酶处理。

 

2.RNA pull-down⼀定要体外转录合成RNA探针吗?

体外转录只是获得RNA的⼀种⽅式，相⽐化学合成纯度更⾼。所以pull-down实验⼀般是体外转录得到目的RNA。当⽬的RNA序列⼤于2000bp时体外转录就不太容易转录成功，这时我们可以设计合成⼀⼩段⽬的RNA探针，通过探针与⽬的RNA结合，再与蛋⽩结合，便可绕过这个问题。

 

3.RNA在转录出来后，其OD⼀般都不高，可以使用吗? 如何定量呢?

OD值不⾼可进⾏RNA纯化，即便不纯化在实验中多加⼀些RNA亦可。⽽定量问题⼀般会进⾏琼脂糖凝胶电泳检测，可以根据marker浓度来判断RNA的浓度。也可以⽤仪器测量RNA的浓度，但通过体外转录得到的RNA浓度都能达到2μg/μL以上。并且pulldown实验不需要精确的定量，都会加⼊过量的探针。

 

4.关于样本处理，细胞或者组织裂解时要不要加蛋白酶抑制剂或RNA酶抑制剂? 还需要进行其他处理吗?操作过程中需要注意什么?

细胞裂解需要加⼊蛋⽩酶和RNA酶抑制剂，最好能够进⾏超声处理。另外裂解蛋⽩的全程尽量在冰上操作。

 

5.Q5:lncRNA引物设计有什么注意事项? 或者说与普通的引物设计有什么区别?

体外转录扩增的引物只需要在正向引物5’端加⼊T7启动⼦序列即可。

 

6.质谱鉴定的蛋白主要是依据打分来进行筛选? 这个筛选多少分算有效?

pull-down富集蛋白质谱分析后会剔除不可信蛋⽩，交付的都是可信蛋白，没有明确的打分。需要排序的话⼀般是根据鉴定蛋白特征性肽段的数目作为参考。

 

7.做lncRNA pulldown + 质谱⼀般都会发现多个互作蛋白对吗? 如何选择哪⼀种蛋白继续研究下去?

不同的RNA结合蛋白数量不等，根据实际鉴定的蛋白进⾏筛选；筛选的原则是根据自己研究的方向或相关功能确定这类蛋白。