分子互作只做Co-IP？试试分子对接+SPR+降解验证

为什么别人的分子对接能发高分文献，你的却总被审稿人质疑？

从“静态照片”到“动态电影”，从“随机发现”到“理性设计”，只差这一步。

做过蛋白-小分子或蛋白-蛋白互作研究的你，一定遇到过这些场景：

●分子对接打分特别漂亮，3D图也画得花团锦簇，结果SPR一做，亲和力弱到怀疑人生；

●细胞实验效果明显，但Co-IP就是拉不下来，想不通到底哪里出了问题；

●想验证某个关键结合位点，凭感觉做了一堆点突变，花费几个月，结果大部分都是阴性。

问题出在哪？不是方法不对，而是工具用错了阶段。

 

1、痛点：为什么你的互作实验经常“翻车”？

场景一：对接漂亮，SPR打脸

你用分子对接找到了一个化合物与靶蛋白“看起来很美”的结合姿势——关键的氢键、合适的疏水口袋、打分也比较理想。

于是你信心满满地去做SPR/BLI，结果：解离飞快，结合能远不如预期。

为什么？

分子对接提供的是“静态照片”，只能说明“这一刻可能碰到了一起”。而真实世界是“动态电影”——蛋白在持续晃动，结合口袋开合变化，水分子和离子也在参与。因此，单纯依赖对接结果，极易落入“假阳性”或“假阴性”的陷阱。

场景二：细胞有效，对接对不上

细胞实验显示化合物有效，分子对接却预测出奇怪的结合模式，甚至与已知关键残基不符。

原因分析：

细胞环境中靶蛋白可能呈现多种构象状态，可能存在磷酸化、泛素化等翻译后修饰，也可能结合辅因子或其他蛋白，而分子对接基于静态晶体结构，难以反映上述动态变化。此外，化合物的表型效应可能源于间接机制（如调控信号通路或蛋白稳定性），无需直接结合靶点即可发挥作用。

解决思路：当对接预测与细胞实验结果不一致时，可采用DARTS、CETSA等靶点解卷积技术直接鉴定化合物的真实结合靶点。

场景三：点突变靠感觉，大海捞针

想验证关键结合位点，凭感觉设计点突变，耗时数月，结果多为阴性。

原因分析：

典型靶蛋白包含数百个氨基酸残基，随机选择突变位点的成功率通常低于20%。盲目突变不仅效率低下，还可能误伤结构关键残基导致蛋白折叠异常。

解决思路：开展点突变实验前，应先通过分子对接预测关键结合残基（如形成氢键、疏水作用、π-π堆积的残基）。进一步可结合分子动力学模拟与MM/GBSA能量分解，定量评估各残基对结合自由能的贡献，实现精准设计。

 

2、闭环思路：分子对接+分子动力学+实验验证

一个好的分子互作研究，应该是这样的三段式：

阶段	技术方法	解决的问题	一句话概括
初筛	分子对接	寻找可能的结合模式	“能不能碰上”
精筛(进阶)	分子动力学模拟	考察结合是否稳定	“结合的紧不紧”
验证	SPR/点突变/Co-IP	实验证实计算结果	“用事实说话”

 

3、核心文献拆解：一篇完整的“干湿结合”闭环研究

下面，我们就以2026年3月24日北大詹启敏院士、张维敏教授团队在线发表于《Advanced Science》（IF=15.1，中科院一区）的论文 《Halofuginone is a Molecular Glue Degrader of Integrin β4》为范例，拆解分子对接和湿实验验证是如何串联成一条完整的闭环证据链的。

研究问题：常山酮（Halofuginone, HF）能否作为分子胶降解剂靶向降解整合素β4（ITGB4），从而抑制食管鳞癌进展？

第一步：靶点发现：高通量筛选 + DARTS质谱 → 锁定整合素β4

研究者首先对173个天然产物进行MTS高通量筛选，在9种食管鳞癌细胞系中测试其杀伤效果。初筛获得44个抑制率超过50%的候选分子，进一步剂量依赖性验证后，常山酮（HF）脱颖而出，其IC50值在0.25-24.77 μM之间，展现出最强的细胞毒性。

图1.候选天然产物的高通量筛选

接下来要回答的问题是：HF的靶点是谁？

研究者采用DARTS技术——该技术利用药物结合后保护靶蛋白免受蛋白酶K降解的原理——将不同浓度的HF与细胞裂解液共孵育，随后加入蛋白酶K进行消化。银染显示存在差异蛋白条带，质谱鉴定后结合人类蛋白图谱数据库筛选，最终从16个膜蛋白中锁定了整合素β4。DARTS-Western Blot进一步确认，HF剂量依赖性地保护整合素β4免受蛋白酶K降解。

为明确整合素β4的临床相关性，研究者对包含107例食管鳞癌组织和72例癌旁组织的芯片进行IHC染色，发现整合素β4在癌组织中显著高表达，且高表达组患者的总体生存期显著更差，Cox回归分析提示其可作为独立预后因素。

核心发现：HF结合整合素β4并降低其蛋白水平，整合素β4高表达与食管鳞癌不良预后显著相关。

图2. DARTS-MS结果图

第二步：结合验证：分子对接（预测关键残基）+ SPR（实测亲和力）

关键问题：HF如何结合？

研究者采用分子对接（AutoDock） 预测HF与整合素β4的结合模式：

发现HF与整合素β4的Ser1325和Ile1326形成两个氢键，距离分别为2.1 Å和3.2 Å（<5 Å满足稳定物理相互作用标准）结合口袋位于整合素β4的C2结构域（第一个FNIII结构域对）

这一步的作用：给出“HF与整合素β4如何结合”的可视化证据，预测了关键结合残基，为后续点突变验证指明了方向。

图3. 分子对接结果图

接下来，研究者进一步验证HF与整合素β4是否直接结合。

用表面等离子体共振（SPR）实验直接验证HF与整合素β4的结合，结果显示解离常数（KD）= 5.855 ± 0.75 μM，证实HF与整合素β4存在中等强度的直接相互作用。

分子对接预测了结合模式和关键残基→ SPR实验验证了确实有结合 → 两者相互印证！

图4. SPR结果图

第三步：分子胶机制探索——降解实验 + 泛素化

HF不仅是结合，更关键的是：它作为一个分子胶降解剂，促进整合素β4通过CRL4B^WDR18 E3泛素连接酶复合物被降解。

实验方法	发现	机制发现
CHX实验	HF加速整合素β4降解（半衰期缩短）	提示是翻译后修饰调控
蛋白酶体抑制剂Mg132	阻断HF诱导的降解	确认是泛素-蛋白酶体途径
泛素化IP	HF剂量依赖性地增强整合素β4泛素化	进一步确认降解途径
siRNA筛选	CUL4B、DDB1、WDR18是必需蛋白	锁定CRL4B^WDR18复合物
Co-IP	HF增强WDR18与整合素β4的结合	“胶水”功能验证

 

第四步：关键结合位点定位——从结构域到氨基酸的逐级锁定

干实验预测：分子对接显示HF结合在整合素β4的C2结构域（包含Ser1325/Ile1326）

湿实验验证：

❖构建C1、C2、C3截短体 → HF选择性降解C2结构域

❖Co-IP显示HF特异性地增强C2与WDR18的相互作用（C3无效应）

❖Ser1325A/Ile1326A双突变→完全废除HF的结合和降解功能

对接预测“HF结合C2结构域的Ser1325和Ile1326” → 截短体验证“C2结构域是功能所必需”→点突变验证“这两个位点突变后功能完全丧失” → 干湿结论完全一致！

 

4、总结

如果你的文章目前还停留在：

只做了分子对接→ 容易被审稿人质疑“为什么不验证？”

只做了Co-IP/SPR → 解释力有限，缺乏分子层面的细节

不妨学学我们解析的这篇Advanced Science的研究思路

“干湿结合”的最高境界，不是简单堆砌数据，而是：

1.先用计算预测（对接找出可能的结合位点和关键残基）

2.再用实验验证（SPR测亲和力、点突变验证关键残基、截短体定位功能域）

3.最后形成闭环（预测与验证一致，且预测指导了实验设计）

但如果想进一步回答“这个结合在动态环境下是否稳定”“结合自由能到底是多少”这类问题，可以在对接之后加入分子动力学模拟——

通过RMSD曲线判断复合物在纳秒到微秒级别下是否稳定

通过MM/GBSA计算定量评估结合自由能，并分解到每个氨基酸残基

这种“对接 + MD + 实验验证”的三位一体策略

上述研究中所使用的SPR表面等离子共振、分子对接、蛋白表达纯化、siRNA、小分子Pull-down、Co-IP等实验技术，金开瑞生物均可提供一站式服务，助您轻松复现高分文献的研究思路。

 

核心参考文献：Gong W, Yang D, Tang J, Chen Y, Yang T, Zhang W, Zhan Q. Halofuginone is a Molecular Glue Degrader of Integrin β4. Advanced Science, 2026. DOI: 10.1002/advs.202515970.