siRNA实验从入门到精通：合成与转染的那些“坑”你踩过吗？

RNA干扰技术自诞生以来，已成为基因功能研究和药物开发的重要工具。然而，看似简单的siRNA实验，实际操作中却暗藏不少“陷阱”。今天，我们从siRNA的合成与转染两个关键环节，聊聊那些容易被忽视的细节。

 

一、siRNA合成：质量决定起点

01、合成方式与纯化

目前实验室常用的siRNA多为化学合成，长度通常在21-25nt之间。合成后的纯化方式直接影响实验结果的稳定性。常见的纯化方法包括HPLC和PAGE，其中HPLC纯化后的产物纯度高、盐分残留低，更适用于细胞转染实验。

 

02、剂型与保存

siRNA产品通常以冻干粉形式提供，常温下可稳定1-2周。长期保存建议置于-20℃至-80℃。值得注意的是，冻干粉在运输过程中可能因静电吸附在管壁，开盖前建议短暂离心，确保样品集中在管底。

溶解时推荐使用DEPC水，储存浓度一般配制成20 μmol/L。溶解后的siRNA应分装保存，避免反复冻融（尽量不要超过5次），否则会显著降低活性。

 

二、对照体系的设计

一个完整的RNAi实验，离不开合理的对照设置：

通用阴性对照（NC）：

通用阴性对照和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和目的基因mRNA序列没有明显的同源性；阴性对照需要确定和目的靶细胞中其它基因也没有同源性。

荧光标记通用阴性对照（Fam-NC）：

荧光标记阴性对照与通用阴性对照的序列是相同的，通过标记荧光，方便在荧光显微镜下直接观察转染情况，可用于优化转染条件和评价转染效率。

阳性对照（GAPDH或者actin）：

阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。可以利用阳性对照来确认RNAi实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法是可靠的。例如GAPDH阳性对照，是一个肯定能将GAPDH基因给干扰掉的siRNA，如果实验后发现GAPDH没有被干扰掉，说明实验系统出问题了。如果GAPDH被干扰掉了，说明实验操作没有问题。

转染试剂对照：对于⼀个完善的对照系统，转染试剂对照是不可缺的。指“仅加转染试剂不加siRNA”的孔，用于排除转染试剂本身对细胞或检测指标的干扰。

 

三、siRNA转染：细节决定成败

01、细胞状态与密度

转染时细胞的生长状态至关重要。一般建议细胞密度控制在70%-80%（部分转染试剂对密度容忍度更高，可低至40%-50%）。细胞过密或过稀都会影响转染效率。此外，实验前12小时可更换为无抗生素无血清培养基，以避免抗生素对转染试剂的干扰。

 

02、转染复合物的制备

以24孔板为例，所有试剂⽤量和体积均是按每孔计算：

贴壁细胞：转染前⼀⽇，每孔0.5-2.0×10⁵ 个细胞接种于500µL含抗⽣素的培养基中，转染时细胞⻓⾄70%融合最佳。

（1）稀释转染试剂：使用前，将转染试剂放置于室温中，轻轻混匀，然后在⽆菌管中加⼊50μL无血清培养基或OPTI-MEM，再加⼊2μL转染试剂，⽤移液器轻轻混匀，室温静置5min；

（2）稀释siRNA：在另一无菌管中加⼊50μL无血清培养基或OPTI-MEM，并添加2μLsiRNA，⽤移液器轻轻混匀，室温静置5min；

（3）将转染试剂培养基混合物滴加⾄siRNA培养基混合物中，⽤移液器轻轻混匀，室温静置15~20min。

注意：稀释后的转染试剂不宜放置过久，建议30分钟内与siRNA混合。

 

03、转染操作与换液

将制备好的100 μL转染复合物加入已更换400 μL新鲜培养基的细胞孔中，总体系500 μL。轻轻晃动培养板使复合物分布均匀。转染4-6小时后可更换为完全培养基，以降低转染试剂可能带来的细胞毒性（实际根据所用转染试剂的说明书操作）。

 

04、检测时间窗口

mRNA水平检测：转染后24-72小时进行，qPCR是公认的标准方法。检测时间过晚可能导致靶基因已被降解或细胞出现适应性变化。

蛋白水平检测：转染后48-96小时进行，常用Western Blot。若蛋白水平变化不明显，建议先确认mRNA水平是否成功敲低。

 

四、如何正确判断siRNA转染阳性率

实验操作要点

1.使用荧光标记的阴性对照

通过转染带荧光标记的siRNA（如FAM标记阴性对照），在荧光显微镜下观察细胞内的荧光情况。

 

2.观察前务必清洗细胞

观察前应用PBS清洗细胞培养板两遍，洗去含转染复合物的培养基。

若不清洗，培养基中的游离荧光物质会产生强背景荧光，掩盖细胞内真正的荧光信号，导致误判为转染失败。

同时，不清洗时细胞表面可能吸附荧光标记的siRNA或细小荧光颗粒，造成假阳性判断。

 

3.正确调节显微镜焦距

缺乏显微镜操作经验的研究者容易因调焦不当而看不到细胞内荧光点，误判为转染阴性。应耐心调节焦距，寻找细胞质内清晰的点状荧光。

转染阳性率的判断意义与误区

1.转染阳性率仅为初步参考指标

转染阳性率仅反映siRNA是否被转入细胞，不能代表siRNA能否被有效释放并发挥基因沉默作用。
判断siRNA转染效果的金标准是目标基因mRNA的敲降水平（如qPCR检测），而非荧光阳性率。

 

2.荧光强度≠转染效率

一些转染试剂（如阳离子脂质体、PEI类）转染后细胞内荧光很强、很亮，但基因沉默效率却很低。

原因在于：这类试剂正电荷较强，能结合大量荧光标记siRNA，但进入细胞后释放缓慢，导致siRNA聚集在胞内无法发挥作用。

真正高效的siRNA转染，呈现的荧光应为有折光感、分散于细胞质中的点状荧光，而非大面积弥漫性强荧光。

siRNA实验的成功，离不开从合成到转染每一个环节的精细把控。高质量的siRNA、完善的对照体系、高效的转染试剂，三者缺一不可。

其中，转染试剂尤为关键。但市面上不少转染试剂虽然能“带”siRNA进细胞，却无法高效释放，导致荧光很强、敲降却很低。真正理想的转染试剂，应兼具高效递送、低毒性、操作简便、适用范围广等特点。

 

金开瑞的Pepincell™ Transfection Reagent for siRNA正是这样一款产品：

示例细胞转染效率

Cell lines	Target gene	Gene silencing efficiency
HEK 293	Luciferase	>90%
GL 261	Luciferase
4T1	Luciferase	>80%
B16	Luciferase

❖高效转染：siRNA专用，HEK 293细胞基因沉默效率 >90%

❖低毒性：改良聚合物结构，离子强度低，对细胞更友好

❖操作简便：稳定性好，重复性高

❖适用范围广：对细胞覆盖度容忍度高，40%覆盖率仍可高效转染

❖适用于难转染细胞：如原代细胞