基因合成的“纯度等级”有什么区别？不同实验场景该如何选择？

    Desalted、PAGE、HPLC三种纯度等级的核心区别在于纯化原理不同，导致最终去除杂质的能力和获得的核酸纯度有差异，进而适配不同精度要求的实验场景。

一、三种纯度等级的核心区别

    三者的主要差异体现在纯化方法、纯度水平和适用的片段长度上，决定了它们能去除的杂质类型（如盐类、短片段寡核苷酸、非全长产物等）。

1.Desalted（脱盐级）

    纯化原理：通过简单的脱盐柱或离心柱，主要去除合成过程中残留的盐类、小分子量有机杂质，无法有效去除短片段寡核苷酸（如未完全合成的短链）。

    纯度水平：最低，仅保证核酸无盐干扰，无法保证产物均一性，可能混有短链杂质。

    适用片段：通常用于短片段（如20-40nt的引物），长片段（>80nt）不推荐。

 

2.PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳级）

    纯化原理：利用凝胶电泳的分子筛效应，根据核酸片段的分子量大小分离，能有效去除非全长的短片段、错配片段，仅收集目标长度的核酸条带。

    纯度水平：中等偏上，可去除90%以上的短链杂质，产物均一性较好。

    适用片段：适合中短片段（如40-100nt的引物、小干扰RNA），长片段纯化效率会下降。

3.HPLC（高效液相色谱级）

    纯化原理：基于核酸分子与色谱柱填料的相互作用差异（如反相HPLC基于疏水性），分离目标核酸与杂质（包括短链、错配、修饰异常的产物）。

    纯度水平：最高，能去除95%以上的杂质，产物纯度和均一性最优，且可精准分离修饰后的核酸（如荧光标记、甲基化修饰的片段）。

    适用片段：无明显长度限制，从短引物到长片段（>100nt的基因片段、CRISPRsgRNA）均适用，尤其适合修饰型核酸。

 

二、不同实验场景的选择策略

    选择的核心逻辑是：实验对核酸纯度的要求越高、片段越长或修饰越复杂，就需要选择更高纯度的等级。

1.低要求场景：优先选Desalted

    适用于对纯度要求低、仅需避免盐干扰的实验，性价比最高。

    常规PCR扩增：用于合成普通PCR引物，短片段（<40nt）的引物脱盐后即可满足扩增需求。

    普通测序引物：用于Sanger测序的短引物，脱盐级可避免盐类对测序反应的干扰。

    简单的核酸杂交实验：如Southernblot、Northernblot的探针（短片段），无需极高纯度。

 

2.中高要求场景：优先选PAGE

    适用于需要去除短链杂质、保证产物均一性的实验，平衡纯度与成本。

    小干扰RNA（siRNA）合成：siRNA长度通常为21-23nt，需去除未配对的单链杂质，否则会影响沉默效率。

    中等长度引物（40-80nt）：如用于长片段PCR、巢式PCR的引物，短链杂质可能导致非特异性扩增，需PAGE纯化。

    简单的基因片段克隆（<100nt）：如插入短片段到载体中，避免短链杂质干扰连接反应。

 

3.高要求场景：必须选HPLC

    适用于对纯度要求极高、片段较长或含特殊修饰的实验，直接影响实验成败。

    细胞转染实验：包括siRNA、shRNA、mRNA转染，高纯度可避免杂质对细胞的毒性，同时保证转染后分子的活性。

    载体构建（尤其是长片段插入）：如插入>100nt的基因片段到质粒、病毒载体中，HPLC可去除错配、缺失的片段，减少重组载体的突变率。

    CRISPR/Cas9实验：sgRNA（通常>80nt）需极高纯度，杂质会降低向导RNA的靶向效率，导致脱靶效应增加。

    修饰型核酸实验：如荧光标记、生物素标记、甲基化修饰的核酸，HPLC可精准分离修饰正确的产物，保证后续检测（如荧光成像、pull-down实验）的准确性。