ChIP-qPCR和ChIP-seq染色质免疫沉淀工作流程解决方案

    染色质免疫沉淀（ChIP）是研究蛋白质与DNA相互作用的核心技术，ChIP-qPCR用于验证特定DNA区域与靶蛋白的结合，ChIP-seq用于全基因组范围内筛选靶蛋白的结合位点。二者的核心工作流程一致，仅在后续检测环节存在差异，以下是完整的标准化解决方案：

 

一、实验核心原理

    通过甲醛交联将细胞内瞬时结合的蛋白质-DNA复合物固定，超声破碎染色质为小片段，利用特异性抗体免疫沉淀靶蛋白及其结合的DNA片段，解除交联后纯化DNA，再通过qPCR或高通量测序分析目标DNA序列。

 

二、完整工作流程（ChIP-qPCR&ChIP-seq通用前处理）

阶段1：细胞样品准备与交联固定

（1）细胞培养与处理

    培养目标细胞至对数生长期，根据实验需求进行处理（如药物刺激、基因过表达/敲低）。

    取适量细胞（ChIP-qPCR约1×10⁶个；ChIP-seq需5×10⁶~1×10⁷个），用预冷的PBS洗涤2次。

 

（2）甲醛交联

    加入终浓度1%甲醛（新鲜配制），室温轻摇10~15min，固定蛋白质-DNA复合物。

    加入终浓度0.125mol/L甘氨酸，室温轻摇5min，终止交联反应。

 

（3）收集细胞

    离心收集细胞沉淀，用预冷的PBS重悬洗涤，再次离心，弃上清。沉淀可-80℃保存，或直接进行下一步。

阶段2：染色质提取与超声破碎

（1）细胞裂解与细胞核分离

    向细胞沉淀中加入预冷的裂解缓冲液（含PMSF、蛋白酶抑制剂），冰上孵育10min，裂解细胞质膜。

    离心收集细胞核沉淀，用预冷的核裂解缓冲液重悬，冰上孵育10min，裂解核膜，释放染色质。

 

（2）超声破碎染色质

    超声仪冰上操作，将染色质打断为200~500bp的片段（ChIP-seq建议200~300bp，保证测序分辨率）。

    超声参数优化：功率20%~40%，工作3s，间隔10s，循环15~25次（需预实验确定最佳参数）。

​​​​​​​    取少量样品，酚-氯仿抽提DNA，琼脂糖凝胶电泳验证片段大小，合格后进行下一步。

 

（3）去除不溶性杂质

    4℃高速离心10min，取上清（含可溶性染色质片段），分装保存，避免反复冻融。

 

阶段3：免疫沉淀（IP）捕获靶蛋白-DNA复合物

（1）预清除（减少非特异性结合）

    向染色质上清中加入ProteinA/G琼脂糖珠（或磁珠），4℃轻柔摇晃2h，封闭珠体的非特异性结合位点。

​​​​​​​    离心收集上清，弃去珠体，降低背景信号。

 

（2）抗体孵育

    向预清除后的染色质中加入靶蛋白特异性抗体（ChIP级抗体，至关重要），同时设置阴性对照（IgG）和阳性对照（已知结合位点的抗体）。

​​​​​​​    4℃轻柔摇晃孵育过夜（12~16h），使抗体与靶蛋白充分结合。

 

（3）捕获免疫复合物

    加入ProteinA/G琼脂糖珠/磁珠，4℃轻柔摇晃2~4h，让珠体结合抗体-靶蛋白-DNA复合物。

​​​​​​​    若使用磁珠，直接磁力架吸附；若使用琼脂糖珠，低速离心收集沉淀。

 

（4）洗涤（去除非特异性结合）

    用不同洗涤缓冲液依次洗涤珠体，洗涤强度逐步增加：

​​​​​​​    低盐洗涤缓冲液→2次

​​​​​​​    高盐洗涤缓冲液→1次

​​​​​​​    LiCl洗涤缓冲液→1次

​​​​​​​    TE缓冲液→2次

​​​​​​​    每次洗涤均轻柔颠倒混匀，冰上操作，彻底去除未结合的DNA和杂蛋白。

 

阶段4：交联解除与DNA纯化

（1）洗脱复合物

    向洗涤后的珠体中加入洗脱缓冲液（含1%SDS、0.1mol/L NaHCO₃），65℃水浴摇床孵育15min，重复2次，合并洗脱液。

 

（2）解除交联

    向洗脱液中加入5mol/LNaCl，终浓度0.2mol/L，65℃水浴孵育4~6h或过夜，彻底解除蛋白质-DNA交联。

 

（3）蛋白酶K消化

    冷却至室温，加入蛋白酶K（终浓度50μg/mL）和EDTA，45℃孵育1~2h，降解靶蛋白和抗体。

 

（4）DNA纯化

    酚-氯仿抽提1次，氯仿抽提1次，回收上清。

​​​​​​​    加入糖原（助沉剂）和2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀2h以上或过夜。

​​​​​​​    4℃高速离心，70%乙醇洗涤沉淀2次，晾干后用适量TE缓冲液溶解DNA。

​​​​​​​    纯化后的DNA可-20℃保存，分别用于ChIP-qPCR或ChIP-seq检测。

 

三、后续检测：ChIP-qPCR与ChIP-seq分向操作

1、ChIP-qPCR（验证特定DNA位点结合）

（1）引物设计

    针对候选的靶DNA区域设计特异性引物，产物长度80~150bp；同时设计阴性对照区域引物（无靶蛋白结合的序列）。

 

（2）qPCR扩增

    以纯化的ChIPDNA为模板，设置IgG对照组、Input对照组（超声后未进行IP的染色质DNA），进行实时荧光定量PCR。

 

（3）数据分析

    计算目的基因的富集效率：富集率=2^(-ΔΔCt)×100%

    以Input为参照标准，比较靶抗体组与IgG组的富集差异，判断靶蛋白与候选DNA位点的特异性结合。

 

2、ChIP-seq（全基因组结合位点筛选）

（1）文库构建

    对纯化的ChIPDNA进行末端修复、加A尾、连接测序接头，PCR扩增富集文库片段。

​​​​​​​    琼脂糖凝胶电泳筛选200~300bp的文库片段，质检合格后进行测序。

 

（2）高通量测序

    采用二代测序平台（如Illumina）进行单端或双端测序，测序深度根据研究需求调整（一般需10~20Gb数据量）。

 

（3）生物信息学分析

    数据质控：去除低质量reads和接头序列。

​​​​​​​    序列比对：将cleanreads比对到参考基因组（如Bowtie、BWA软件）。

​​​​​​​    峰（peak）识别：用MACS2等软件识别靶蛋白结合的富集区域（peak）。

​​​​​​​    注释与功能分析：对peak进行基因注释，结合GO、KEGG分析，挖掘靶基因的功能通路。

 

四、关键注意事项

​​​​​​​    抗体选择：必须使用ChIP级特异性抗体，预实验验证抗体的免疫沉淀效率。

​​​​​​​    超声参数优化：片段大小直接影响实验结果，需多次预实验确定最佳超声条件。

​​​​​​​    对照设置：严格设置Input、IgG阴性对照、阳性对照，确保实验可靠性。

​​​​​​​    避免污染：全程无酶操作，防止外源DNA污染；ChIP-seq文库构建需在超净工作台进行。