萤火虫荧光素酶提取方法有哪些？

    萤火虫荧光素酶（FireflyLuciferase，FLuc）的提取方法主要取决于你的实验目的（是用于体外活性检测、蛋白纯化，还是抗体制备）以及样本类型（是双荧光素酶报告基因实验中的裂解液，还是天然萤火虫提取物）。

    在分子生物学和药物研发（如你之前提到的双荧光素酶实验）中，最常用的是细胞裂解液提取法。以下是详细的分类介绍：

 

1、细胞裂解液提取法（最常用，用于报告基因检测）

    这是进行双荧光素酶报告基因实验时的标准操作，目的是快速释放细胞内的酶蛋白以便进行活性测定。

    原理：利用去污剂（如TritonX-100或NonidetP-40）破坏细胞膜和核膜，使胞内蛋白释放到缓冲液中。

 

（1）常用试剂：

    PLB裂解液(PassiveLysisBuffer)：这是Promega等公司提供的专用缓冲液，含有非离子去污剂。

    自制裂解液：通常包含Tris-HCl(pH7.8)、EDTA、DTT（保护酶活性）、甘油（增加稳定性）和TritonX-100（裂解细胞）。

 

（2）操作步骤：

    去除培养基：吸去细胞培养板中的培养基，用PBS洗涤细胞1-2次，洗去残留血清。

    加入裂解液：根据培养皿大小加入适量的预冷裂解液（例如96孔板每孔加20-100μL）。

    裂解：轻轻摇晃培养板，使裂解液覆盖所有细胞，室温孵育15-20分钟（或4℃摇床孵育），期间可轻轻拍打板壁辅助裂解。

    收集：将裂解液转移至离心管中。

    澄清：12,000rpm4℃离心2-5分钟，取上清液。

    注意：此上清液即可直接用于荧光素酶活性检测。由于荧光素酶对温度敏感且易降解，提取后应尽快测定，或短暂放置于冰上。

2、原核表达系统的蛋白纯化法（用于获得高纯度蛋白）

    如果你是通过大肠杆菌（E.coli）重组表达萤火虫荧光素酶，需要获得高纯度的蛋白用于结构研究或作为标准品。

    原理：利用融合标签（Tag）与特异性树脂的亲和作用进行分离。

 

（1）常用标签：

    6×His标签：最常用，结合Ni-NTA或Co-NTA树脂。

    GST标签：结合谷胱甘肽树脂。

 

（2）操作流程：

    诱导表达：将含有荧光素酶质粒的大肠杆菌培养至对数期，加入IPTG诱导蛋白表达。

    菌体破碎：收集菌体，重悬于缓冲液中，通过超声波破碎或高压均质破坏细胞壁。

    亲和层析：将上清液过柱子（如Ni柱），标签与树脂结合，杂蛋白流出。

    洗脱：使用高浓度咪唑（针对His标签）洗脱目的蛋白。

    透析/超滤：去除洗脱液中的高浓度咪唑，置换到保存缓冲液中。

    浓缩：使用超滤管浓缩蛋白浓度。

 

3、天然萤火虫提取物制备（传统方法）

    这是最早的提取方式，从萤火虫（通常是北美萤火虫Photinuspyralis）尾部发光器官中提取。

    原理：利用研磨和有机溶剂沉淀去除杂质。

 

（1）操作步骤：

    收集：收集大量萤火虫尾部发光器。

    匀浆：在冷的缓冲液中进行研磨。

    硫酸铵分级沉淀：利用不同饱和度的硫酸铵沉淀蛋白，荧光素酶通常在较高饱和度下沉淀。

    透析：去除盐分。

    进一步纯化：通过柱层析（如凝胶过滤层析）进一步纯化。

    现状：由于产量低、成本高且不稳定，现代科研中已极少使用此法，几乎全部被重组表达蛋白取代。

 

4、无细胞蛋白合成系统（体外翻译）

    原理：利用兔网织红细胞裂解液或小麦胚芽提取物，直接加入荧光素酶的mRNA或DNA模板进行体外翻译。

    应用：常用于快速验证质粒构建是否正确，或用于体外研究翻译调控机制。

 

    如果你是做双荧光素酶实验：请直接使用方法1（细胞裂解液提取法）。使用商业化的PLB裂解液最为方便，且能最大程度保证萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性平衡。

    如果你需要大量纯蛋白：请选择方法2（原核表达纯化）。

 

关键注意事项：

    温度：荧光素酶是热不稳定蛋白，全程操作（裂解、离心、测定）应尽量在冰上或4℃进行。

    保护剂：提取缓冲液中通常需要加入DTT（还原剂）和甘油，以维持酶的空间结构。

    避免反复冻融：提取后的蛋白若不立即使用，应分装后-80℃保存。