蛋白和蛋白相互作用怎么验证?

    验证蛋白-蛋白相互作用（PPI）的方法可分为体外验证、细胞内验证和体内验证三大类，不同方法的验证维度、特异性、灵敏度不同，适配的研究场景（如初步筛选、精准验证、生理条件下的互作确认）也有差异，实验中常组合多种方法交叉验证，确保互作的真实性和可靠性。以下按从简单到复杂、从体外到体内的逻辑梳理核心方法，说明其原理、应用场景和优缺点，兼顾基础实验和进阶研究需求：

 

一、体外验证方法：直接检测蛋白间的物理相互作用，排除细胞内其他因子干扰

    这类方法使用纯化的重组蛋白或体外表达的蛋白进行实验，核心验证“两个蛋白是否能直接结合”，是PPI验证的基础初筛手段，适合快速确认互作的直接性。

 

1、GST pull-down（谷胱甘肽S-转移酶下拉实验）

    原理：将其中一个蛋白与GST融合表达（诱饵蛋白），结合在谷胱甘肽琼脂糖珠上，与另一个目标蛋白（猎物蛋白）的纯化液/细胞裂解液孵育，若二者结合，猎物蛋白会随诱饵蛋白一起被“下拉”，通过WB检测珠上的猎物蛋白即可验证互作。

    场景：初步验证两个蛋白是否存在直接物理相互作用，也可筛选细胞裂解液中与诱饵蛋白结合的未知互作蛋白。

    特点：操作简单、成本低；可检测瞬时/弱相互作用（可通过优化孵育条件增强）；但无法反映细胞内的真实互作环境。

 

2、Co-IP（体外共免疫沉淀，非细胞内）

    原理：与细胞内Co-IP类似，但使用纯化的重组蛋白进行孵育，通过针对其中一个蛋白的特异性抗体捕获蛋白复合物，WB检测另一个蛋白的存在。

    场景：验证纯化蛋白间的直接结合，排除细胞内其他蛋白的介导作用。

    特点：特异性高于GSTpull-down（依赖抗体特异性）；仅适用于已知候选蛋白的互作验证。

 

3、SPR（表面等离子体共振）

    原理：将一个蛋白固定在芯片表面，另一个蛋白通过溶液流经芯片，若二者结合，会改变芯片表面的等离子体共振信号，可实时定量检测结合动力学参数（结合常数Ka、解离常数Kd、亲和力KD）。

    场景：精准验证直接互作并定量分析结合能力，适合研究互作的强弱、药物对PPI的调控作用。

    特点：无标记、高灵敏度、可定量；但仪器昂贵，需高质量的纯化蛋白。

 

4、EMSA（电泳迁移率变动实验）

    原理：若互作蛋白为核酸结合蛋白+伴侣蛋白（如转录因子+共激活因子），二者结合后会形成分子量更大的复合物，在非变性电泳中迁移速率慢于单个蛋白，出现条带偏移。

    场景：验证与核酸结合相关的蛋白互作，同时可反映互作对蛋白-核酸结合的影响。

    特点：可直观看到复合物形成；但适用范围窄，仅针对核酸相关PPI。

二、细胞内验证方法：检测活细胞/细胞裂解液中内源性/外源性蛋白的互作，贴近生理条件

    这类方法在培养的细胞系中进行，可使用外源性过表达蛋白或检测内源性蛋白，核心验证“两个蛋白在细胞内是否能形成复合物”，部分方法可定位互作发生的亚细胞区域，是PPI验证的核心手段。

 

1、Co-IP（细胞内共免疫沉淀）

    原理：利用细胞裂解液中的天然蛋白复合物，通过针对其中一个蛋白的特异性抗体（内参/标签抗体）将复合物沉淀下来，WB检测复合物中另一个目标蛋白的存在，证明二者在细胞内结合。

    场景：验证细胞内内源性/外源性蛋白的互作，是PPI验证的金标准方法之一。

    特点：贴近细胞生理环境，能检测生理状态下的互作；但仅能检测稳定的蛋白复合物，瞬时/弱互作易漏检；需保证抗体的特异性（避免非特异性结合）。

 

2、IF/ICC（免疫荧光/免疫细胞化学）

    原理：用两种不同荧光标记的抗体分别标记两个目标蛋白，通过激光共聚焦显微镜观察荧光信号的共定位情况，若二者在细胞内的同一亚细胞区域（如细胞核、细胞质、细胞膜）重叠，提示存在互作的空间基础，结合Co-IP可确认互作。

    场景：验证蛋白互作的亚细胞定位，补充Co-IP的结果（证明互作发生的位置）。

    特点：直观、可定位；但共定位≠直接结合，需与其他方法联合验证；无法区分直接/间接互作。

 

3、BiFC（双分子荧光互补）

    原理：将荧光蛋白（如YFP、GFP）拆分为两个无荧光的N端和C端结构，分别与两个目标蛋白融合表达，若两个目标蛋白在细胞内结合，会带动荧光蛋白的两个片段靠近并重构为有活性的荧光蛋白，在活细胞中直接观察到荧光信号。

    场景：验证活细胞内的蛋白互作，并精准定位互作发生的亚细胞区域；可检测瞬时/弱互作。

    特点：活细胞检测、实时可视化、高灵敏度；但外源性融合蛋白可能影响蛋白的天然构象，存在假阳性；无法定量结合能力。

 

4、Luciferase Complementation Assay（荧光素酶互补实验）

    原理：与BiFC类似，将萤火虫荧光素酶拆分为N端和C端，分别与两个目标蛋白融合表达，若二者结合，荧光素酶的两个片段重构为有活性的酶，催化底物产生荧光，可定量检测荧光信号强度反映互作强弱。

    场景：活细胞内定量验证PPI，也可用于高通量筛选（如筛选调控PPI的药物、突变体）。

    特点：活细胞检测、可定量、灵敏度高；适配高通量实验；但同样存在外源性蛋白的构象干扰问题。

 

5、FRET（荧光共振能量转移）

    原理：将两个目标蛋白分别与供体荧光蛋白和受体荧光蛋白融合，若二者在细胞内的距离小于10nm（直接结合的距离），供体荧光被激发后会将能量转移给受体荧光，检测到受体荧光信号即可证明直接互作。

    场景：验证活细胞内的直接蛋白互作，可实时检测互作的动态变化（如药物处理后的互作解离）。

    特点：高特异性（仅检测近距离直接互作）、活细胞实时检测；但仪器要求高，实验条件优化难度大。

 

三、体内验证方法：检测整体动物模型中蛋白的互作，反映生理/病理条件下的真实互作

    这类方法在模式生物（如小鼠、果蝇、斑马鱼）中进行，核心验证“两个蛋白在生物体内的生理/病理状态下是否存在功能性互作”，是PPI验证的最终确证手段，适配后续的功能研究。

 

1、Co-IP（组织样本共免疫沉淀）

    原理：与细胞内Co-IP一致，只是将实验材料替换为模式生物的组织样本裂解液，检测内源性蛋白在体内组织中的复合物形成。

    场景：确证蛋白在体内生理条件下的真实互作，是连接细胞实验和体内功能的关键。

    特点：最贴近体内真实环境；但组织样本中蛋白丰度低，需优化提取和沉淀条件。

 

2、Co-IP结合基因编辑动物模型

    原理：通过CRISPR/Cas9构建蛋白敲除/点突变动物模型，若突变某蛋白的互作结构域后，另一个蛋白的结合能力消失，且伴随相应的表型变化，可证明该互作具有体内功能性意义。

    场景：验证PPI的体内功能相关性，明确互作对生物表型的影响。

    特点：直接关联互作与生理功能；但实验周期长、成本高。

 

3、荧光素酶互补成像（In Vivo Luciferase Complementation）

    原理：将融合了荧光素酶片段的两个目标蛋白通过转基因/病毒注射导入动物体内，若二者在体内结合，重构的荧光素酶会催化底物产生荧光，通过活体成像仪在体观察荧光信号，证明体内互作。

    场景：在体实时观察蛋白互作的时空分布（如不同组织、不同发育阶段的互作）。

    特点：体内可视化、无侵入性；但灵敏度较低，需高表达融合蛋白。

 

四、高通量筛选互作蛋白的方法：适合从全基因组/蛋白组水平筛选未知互作蛋白

    若仅知道一个诱饵蛋白，想筛选其潜在的未知互作蛋白，可使用以下高通量方法，后续需通过上述验证方法确认具体的PPI：

 

1、酵母双杂交（Y2H）

    原理：将诱饵蛋白与GAL4的DNA结合域融合，猎物蛋白与GAL4的激活域融合，若二者在酵母细胞核内结合，会重构GAL4的转录激活功能，驱动报告基因（如His3、LacZ）的表达，通过酵母生长/显色筛选阳性克隆。

    场景：全基因组水平筛选与诱饵蛋白互作的未知蛋白，适合PPI的初步高通量筛选。

    特点：高通量、成本低；但假阳性率高（酵母内的异源表达易导致非特异性结合）；仅能检测细胞核内的互作（经典Y2H），后续需改造系统（如膜酵母双杂交）适配膜蛋白互作。

 

2、免疫共沉淀结合质谱（Co-IP-MS）

    原理：用特异性抗体沉淀细胞/组织中的内源性蛋白复合物，通过质谱技术鉴定复合物中的所有蛋白，筛选出与诱饵蛋白结合的候选互作蛋白。

    场景：筛选生理条件下与诱饵蛋白结合的未知互作蛋白，鉴定PPI网络。

    特点：贴近生理环境、假阳性率低；可筛选全蛋白组水平的互作蛋白；但质谱仪器昂贵，需后续的单靶点验证。

 

五、PPI验证的核心实验原则：交叉验证，排除假阳性

    单一方法的验证结果存在局限性（如假阳性、无法区分直接/间接互作），实验中需遵循“体外+细胞内”“定性+定量”的交叉验证原则，例如：

    1、初步筛选：GST pull-down（体外直接）+酵母双杂交（高通量）；

    2、细胞内验证：Co-IP（确认复合物形成）+IF（验证共定位）+BiFC（活细胞验证）；

    3、精准定量：SPR（体外结合动力学）+荧光素酶互补（细胞内定量）；

    4、体内确证：组织样本Co-IP（体内生理互作）+基因编辑动物模型（功能相关性）。

    同时，需设置严格的阴性对照（如空载体、突变体对照：突变蛋白的互作结构域，验证互作的特异性），排除非特异性结合、抗体交叉反应、融合蛋白构象干扰等导致的假阳性。

 

六、不同研究场景的方法选择建议

    1、已知两个候选蛋白，验证是否直接互作：GST pull-down+Co-IP+SPR；

    2、已知诱饵蛋白，筛选未知互作蛋白：酵母双杂交+Co-IP-MS；

    3、研究PPI的亚细胞定位：IF+BiFC+FRET；

    4、研究药物对PPI的调控作用：SPR（体外定量）+荧光素酶互补（细胞内高通量筛选）；

    5、验证PPI的体内生理功能：组织Co-IP+基因编辑动物模型。