以重组蛋白为抗原的多克隆抗体定制，对蛋白的纯度、可溶性、完整性有什么要求？

    以重组蛋白为抗原定制多克隆抗体时，高纯度（通常>90%）、良好可溶性、完整的蛋白结构是基础要求，任何一项不满足都会显著影响抗体的特异性、效价或实用性。

一、对蛋白纯度的要求（通常需>90%）

    蛋白纯度是保证抗体特异性的关键，杂质会直接引入非特异性抗体，干扰后续实验。

1、核心要求

    通过SDS-PAGE或HPLC检测，目标蛋白纯度需达到90%以上，优先选择95%以上的纯品。

 

2、不满足的后果

    产生大量非特异性抗体。蛋白中的杂蛋白（如表达宿主的蛋白、纯化残留的标签蛋白）会被免疫系统识别，导致最终制备的多抗中混杂针对杂蛋白的抗体。

    干扰实验结果。在WesternBlot、ELISA等应用中，非特异性抗体会与样品中的杂蛋白结合，出现假阳性条带或高背景信号，无法准确判断目标蛋白的表达或含量。

    增加抗体纯化难度。若需后续纯化特异性抗体（如亲和纯化），会提高实验成本和操作复杂度，且难以完全去除非特异性抗体。

二、对蛋白可溶性的要求

    可溶性蛋白能保证抗原有效暴露免疫原性位点，是激发机体产生高效价抗体的前提。

1、核心要求

    蛋白需溶解在合适的缓冲液（如PBS、Tris-HCl）中，无明显沉淀或聚集，浓度稳定（通常需达到0.5-2mg/mL，满足免疫剂量需求）。

 

2、不满足的后果

    免疫原性降低。不可溶的蛋白（如包涵体形式）易形成聚集体，导致表面的免疫原性位点被掩盖，无法有效激活B细胞产生抗体，最终抗体效价极低甚至无特异性抗体。

    引发非特异性免疫反应。蛋白聚集体可能作为“异物”刺激机体产生针对“聚集结构”的抗体，而非针对目标蛋白线性或构象表位的特异性抗体，进一步降低抗体实用性。

    无法完成免疫流程。若蛋白反复沉淀，无法按标准剂量（如每只小鼠每次50-100μg）进行皮下或腹腔注射，导致免疫实验中断。

 

三、对蛋白完整性的要求

    完整的蛋白结构（包括线性序列和天然构象）能保证免疫原性位点的完整性，决定抗体能否识别天然状态的目标蛋白。

1、核心要求

    蛋白无明显降解（通过SDS-PAGE检测无明显降解条带），若需识别构象表位（如抗体用于免疫荧光、CoIP），需保持天然构象（可通过圆二色谱、功能活性检测验证）。

 

2、不满足的后果

    抗体识别表位不完整。蛋白降解后，仅剩余部分线性片段，免疫系统只能针对降解片段产生抗体，可能无法识别天然蛋白中完整的功能表位，导致抗体在检测天然蛋白时失效。

    构象依赖性实验失败。若目标应用需要抗体识别蛋白的天然构象（如检测细胞表面膜蛋白），变性或降解的蛋白无法诱导产生构象特异性抗体，导致免疫荧光、流式细胞术等实验无法开展。

    抗体效价波动。降解的蛋白片段免疫原性通常较弱，可能导致不同批次免疫的动物产生的抗体效价差异大，无法保证多抗的稳定性。