含重复序列的siRNA合成通过分段合成和重叠区设计解决？

    含重复序列的siRNA（小干扰RNA）在合成过程中容易因序列的高度重复性引发一系列问题，而分段合成与重叠区设计是针对性解决这些问题的有效策略。以下是具体分析：

一、含重复序列的siRNA合成易出现的问题

1、链内/链间错配与二级结构干扰

    重复序列（如polyA、polyU或正向/反向重复单元）易通过碱基互补形成稳定的茎环结构、发夹结构或自身折叠，导致合成过程中引物/模板结合效率下降，酶促延伸时聚合酶难以通过二级结构区域，甚至引发链延伸终止。

    例如，连续U序列可能因局部碱基堆积作用形成刚性结构，阻碍核苷酸的有序掺入；反向重复序列可能通过链内互补形成“发卡”，直接中断合成链的延伸。

 

2、合成保真度低，错误率升高

    重复序列中碱基种类单一或排列规律一致，会增加酶（如DNA聚合酶）的“滑动”风险——即聚合酶在复制重复单元时发生碱基插入或缺失（移码突变）。例如，合成polyA重复序列时，聚合酶可能因模板链的连续A碱基而错误掺入额外A，或跳过部分A导致缺失，显著降低合成准确性。

 

3、长链合成效率低下，产物均一性差

    重复序列的二级结构和酶滑动问题会随链长增加而加剧。传统化学合成或酶促合成中，长重复序列的完整产物比例低，易产生大量截短片段（因延伸终止）或错误延伸产物，导致最终siRNA的纯度和均一性下降，后续实验中干扰效率波动大。

 

3、分离纯化困难

    含重复序列的siRNA片段与错误产物（如截短体、错配体）的分子量和理化性质接近（尤其长度差异较小时），常规的PAGE或HPLC分离难以有效区分，进一步影响产物纯度。

二、通过分段合成与重叠区设计解决的策略

    针对上述问题，分段合成将长重复序列拆分为短片段，通过重叠区设计实现精准拼接，具体机制如下：

1、分段合成：降低单一序列的复杂性

    将含重复序列的siRNA全长（通常21-23nt，若为长链前体则更长）拆分为2-3个短片段（如10-15nt），每个短片段的重复单元长度缩短，减少二级结构形成的概率。例如，含15个连续A的siRNA可拆分为两个含7-8个A的短片段，单个片段的自身折叠倾向显著降低，合成时酶的滑动风险也随之减少，从而提高各短片段的合成准确性和效率。

 

2、重叠区设计：实现精准拼接与纠错

    重叠区的互补配对作用：在拆分的短片段末端设计6-10nt的重叠区（互补序列），通过碱基配对形成稳定的双链中间体，为连接酶（如T4RNA连接酶）提供精准的连接位点，避免随机连接。例如，片段1的3’端设计“-AUCG-”，片段2的5’端设计互补的“-UAGC-”，通过碱基配对确保拼接方向正确。

    减少重复序列的连续暴露：重叠区可打破重复序列的连续性，例如将连续polyA拆分为“AAACCA”和“CCAAAA”，重叠区“CCA”与“GGT”（互补）拼接后恢复全长，但分段时避免了单一长链重复序列的合成难题。

    拼接后的纠错筛选：若分段合成的短片段存在少量错误，重叠区的互补配对会优先选择正确配对的片段（错误片段因碱基错配导致配对稳定性低），连接后通过PAGE或测序筛选正确全长产物，间接提高最终产物的保真度。

 

3、酶促连接的针对性优化

    结合重叠区设计，选择对二级结构容忍度更高的连接酶（如突变型T4RNA连接酶），并优化反应缓冲液（如添加甜菜碱等助溶剂，破坏碱基间的非特异性相互作用），进一步提高含重复序列片段的连接效率。

 

    含重复序列的siRNA合成的核心挑战是二级结构干扰和合成错误率高，分段合成通过降低单一片段的复杂性减少这些问题，而重叠区设计则通过精准互补确保片段正确拼接，两者结合可有效提升产物的准确性、均一性和合成效率，是解决重复序列合成难题的主流策略。