DNA合成产物的常用纯化方法有哪些？脱盐、PAGE、HPLC纯化的适用范围分别是什么？

    DNA合成产物（尤其是寡核苷酸DNA）的纯化是去除合成过程中产生的截短片段、保护基团、盐离子等杂质的关键步骤，常用的纯化方法主要有脱盐纯化、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化、高效液相色谱（HPLC）纯化三类，此外还有固相萃取（如C18柱纯化）等方法。不同方法的原理和适用范围差异显著，具体如下：

一、DNA合成产物的常用纯化方法

1、脱盐纯化

    这是最基础、最简便的纯化方式，核心原理是利用分子筛或离子交换作用，将合成产物中的小分子盐离子（如铵盐、钠盐）、未完全脱除的保护基团等杂质与目标寡核苷酸分离。常见操作包括透析、离心脱盐柱处理，或是乙醇沉淀后重溶。

    该方法只能去除小分子杂质，无法有效分离与目标片段长度相近的截短产物。

 

2、PAGE纯化

    基于聚丙烯酰胺凝胶电泳的分子筛效应分离DNA片段：不同长度的寡核苷酸在凝胶中迁移速率不同，目标长度的DNA条带可通过电泳被精准分离；电泳后经紫外灯显色、切胶回收、洗脱、沉淀，最终得到高纯度产物。

    该方法的分辨率极高，能有效分离仅相差1个碱基的DNA片段。

 

3、HPLC纯化

    依据DNA片段的疏水特性或离子强度差异实现分离，分为两种主流类型：

    反相高效液相色谱（RP-HPLC）：利用合成DNA末端的疏水保护基团（如DMT）差异分离，适合未完全脱保护的粗产物，分辨率较高；

    离子对高效液相色谱（IP-HPLC）：通过调节缓冲液离子强度，依据DNA片段的电荷数（与长度正相关）分离，可有效区分截短片段与目标产物。

    HPLC纯化自动化程度高，产物纯度和回收率均较优。

 

3、固相萃取纯化（C18柱纯化）

    利用C18填料的疏水作用吸附含DMT保护基团的目标DNA，洗去无保护基团的截短杂质后，再脱除DMT基团并洗脱目标产物，纯度介于脱盐和PAGE/HPLC之间。

二、脱盐、PAGE、HPLC纯化的适用范围

1、脱盐纯化

    核心优势：操作简单、成本低、周期短，产物回收率接近100%。

    适用场景：适用于对纯度要求较低的实验，例如PCR引物、测序引物、探针的初步纯化，或是作为高纯度纯化前的预处理步骤；也可用于短链寡核苷酸（≤20bp）的常规使用。

    不适用场景：无法满足克隆、定点突变、基因合成拼接、荧光定量PCR探针等对纯度要求高的实验。

 

2、PAGE纯化

    核心优势：分辨率最高，能分离相差1个碱基的片段，产物纯度可达95%以上。
适用场景：适用于对纯度要求极高的长链寡核苷酸（>50bp）纯化，例如基因合成的长片段拼接、定点突变引物、RNA合成模板、核酶与适配体的制备等；也可用于去除微量截短杂质，保证后续实验的特异性。

    不适用场景：操作步骤繁琐（切胶、洗脱耗时），产物回收率相对较低（约60%–80%），不适合高通量、大规模的纯化需求。

 

3、HPLC纯化

    核心优势：自动化程度高、重复性好，产物纯度可达90%–98%，回收率高于PAGE纯化。

    适用场景：适用于对纯度要求高且需要规模化制备的场景，例如医用级寡核苷酸药物、荧光标记探针、长链基因合成片段、siRNA等；RP-HPLC适合短链DNA，IP-HPLC适合长链DNA。

    不适用场景：设备成本较高，对操作人员的技术要求高于脱盐纯化；对于长度差异极小的片段，分辨率略低于PAGE纯化。

 

    不同纯化方法的选择需结合寡核苷酸长度、实验用途和成本预算：短链引物用脱盐即可，长链功能片段优先选PAGE或HPLC；科研实验可根据需求选择，工业级或医用级产物则多采用HPLC纯化。