双荧光素酶检测的操作顺序是什么？为什么要先检测报告荧光素酶再检测内参？

    双荧光素酶报告基因检测（Dual-Luciferase Reporter Assay）是基于萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）和海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）两种酶的催化反应发光特性，用于分析基因表达调控的常用技术，其操作顺序和检测先后的选择都有明确的技术逻辑。

 

一、双荧光素酶检测的标准操作顺序

    以常用的Promega双荧光素酶检测试剂盒为例，操作顺序需严格遵循“细胞裂解→检测萤火虫荧光素酶活性（报告）→检测海肾荧光素酶活性（内参）”的流程，具体步骤如下：

 

1、样品准备与细胞裂解

    转染了报告质粒（含萤火虫荧光素酶基因，受目标调控元件驱动）和内参质粒（含海肾荧光素酶基因，受组成型启动子驱动）的细胞，弃去培养基后，加入适量的被动裂解液（PLB）。

    室温振荡裂解或反复冻融裂解，使细胞充分破裂，释放出两种荧光素酶蛋白；离心取上清液作为检测样品。

 

2、检测报告荧光素酶（萤火虫）活性

    将细胞裂解上清液加入发光检测孔中，加入萤火虫荧光素酶检测底物（LARII）。
底物与萤火虫荧光素酶反应，发出560nm左右的黄绿光，立即用荧光检测仪记录发光强度，此为报告基因的发光值（记为F）。

 

3、淬灭萤火虫荧光并启动内参荧光素酶（海肾）反应

    向同一检测孔中加入终止/反应缓冲液（Stop&Glo®），该缓冲液含有的成分会快速淬灭萤火虫荧光素酶的发光信号，同时提供海肾荧光素酶的反应底物（腔肠素）。
海肾荧光素酶催化底物反应，发出480nm左右的蓝光，用荧光检测仪记录发光强度，此为内参基因的发光值（记为R）。

 

4、数据计算与分析

    以报告发光值/内参发光值（F/R）作为最终的相对荧光活性，用于校正转染效率、细胞数量差异等实验误差。

二、先检测报告荧光素酶再检测内参的原因

    这个检测顺序是由两种荧光素酶的反应特性、试剂功能以及实验误差控制需求决定的，核心原因有三点：

 

1、试剂的功能特性决定顺序

    缓冲液兼具淬灭报告信号和启动内参反应的双重功能，且淬灭作用是不可逆的。如果先检测内参，加入的底物无法淬灭后续的报告信号，两种荧光会发生叠加干扰，导致检测数据完全失真；而先检测报告，再用该缓冲液淬灭报告信号，能彻底消除报告荧光对内参检测的干扰，保证内参信号的准确性。

 

2、萤火虫荧光素酶的发光动力学更适合作为先检测的报告

    萤火虫荧光素酶与底物反应的发光属于闪光型发光，信号启动快，峰值高，但会在短时间内衰减；而海肾荧光素酶的发光属于辉光型发光，信号启动稍慢，但持续时间更长。先检测快速衰减的萤火虫荧光，能在信号峰值期完成读数，保证报告信号的灵敏度；后续检测持续稳定的海肾荧光，也不会因信号衰减影响数据可靠性。

 

3、减少实验操作误差

    两种检测在同一反应孔中完成，无需转移样品，避免了多孔操作带来的加样误差、样品损失等问题。先测报告再测内参的顺序，能最大程度利用同一体系的样品，确保两个发光值的匹配性，让F/R比值的校正效果更可靠。