GST pull-down实验流程及应用

    GST pull-down实验基于GST（glutathione-S-transferase），即谷胱甘肽-S-转移酶蛋白，可以与谷胱甘肽（Glutathione，GSH）结合，将GSH固定于磁珠上，形成GSH-磁珠，将已知蛋白X与GST融合表达，获得的GST-X蛋白可与GSH-磁珠结合，若体系中存在与X蛋白互做的蛋白Y，则会形成“磁珠-GSH-GST-X-Y”复合物，与X蛋白互做的蛋白即可被分离并检测。

一、技术优势

    ● 在样本无IP级别抗体，且不能做标签抗体验证时首选，尤其是研究植物方向客户；

    ● 可以验证两个蛋白是否为直接互作；

    ● 可以与Co-IP或酵母双杂交共同验证一个问题；

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二、技术应用

    ● 蛋白质相互作用研究：GST pull-down可用于研究蛋白质间的相互作用，帮助揭示蛋白质互作网络和信号传导途径。通过将目标蛋白质与GST融合，可以通过GST pull-down实验来寻找与其相互作用的蛋白质。

    ● 信号转导研究：GST pull-down可用于研究信号转导通路中的蛋白质相互作用，例如研究激酶与底物之间的相互作用、信号传导复合物的组装等。

    ● 蛋白质结构和功能研究：GST pull-down可以用于确定蛋白质结构域的结合伙伴，帮助研究蛋白质的功能和结构-功能关系。

    ● 细胞周期和细胞凋亡研究：GST pull-down可以用于研究细胞周期调控蛋白、凋亡相关蛋白以及相关信号通路中的蛋白质相互作用。

    ● 药物研发和筛选：GST pull-down可以用于筛选潜在的药物靶点和药物分子与目标蛋白质的相互作用。

    ● 癌症研究：GST pull-down在癌症相关蛋白质相互作用的研究中也有广泛应用，有助于揭示癌症发展和治疗靶点。

    总体而言，GST pull-down技术在蛋白质相互作用研究、信号转导、蛋白质结构和功能研究以及药物研发等领域中发挥着重要作用，为研究人员提供了一种有效的工具来探索蛋白质间的相互作用和功能。

 

三、实验流程
    （1）蛋白提取与蛋白浓度测定；

    （2）pull down前WB检测诱饵蛋白及猎物蛋白的表达；

    （3）pull down实验，包括以下步骤：

        a.磁珠准备，将磁珠分装且标记为实验组和对照组，用预冷的IP洗涤液重悬磁珠；

        b.磁珠结合诱饵蛋白GST-A（实验组加诱饵蛋白GST-A，对照组加标签GST蛋白），静音混合2h后用预冷的IP洗涤液进行洗涤重悬磁珠；

        c.诱饵蛋白结合互作蛋白His-B（实验组合对照组分别加入His-B或总蛋白），4℃静音混合过夜（约16h）后用预冷的IP洗涤液进行洗涤重悬磁珠；

        d.洗脱；

    （4）pull down后WB检测或者MS检测。

 

四、常见问题与解析

1、IP、Co-IP、pull-down的区别？
    通常IP或Co-IP使用组织细胞材料，靶蛋白为内源天然蛋白或组织细胞中过表达蛋白（可融合标签）。Pull-down中的诱饵蛋白一般经重组表达获得。IP和Co-IP需要使用亲和力好的一抗，选购时需注意相应验证数据。

    简单来说，IP捕获目的蛋白，Co-IP捕获目的蛋白和其互作蛋白，pull-down用融合标签的重组蛋白来捕获其互作蛋白。

 

2、我的GST pull-down实验结果含有大量背景信号，怎么办？

    背景信号可能来自于非特异性结合。您可以尝试增加洗脱步骤次数、使用更严格的洗脱条件，或者添加更多的非特异性结合抑制剂，如BSA。

 

3、我的GST pull-down实验得到的蛋白带模糊不清，怎么提高分辨率？

    这可能是由于洗脱条件不足或者蛋白纯度不高引起的。您可以增加洗脱液中洗脱剂的浓度，提高纯度，或者考虑使用其他柱层析方法提纯蛋白。

 

4、如何区分蛋白表达在上清还是包涵体？

    蛋白有可能表达在上清也可能表达在包涵体中，超声碎菌之后，如果菌液比较清亮，沉淀比较少，那表达的蛋白基本是可溶的；如果超声之后，菌液是浑浊的，而且在离心后沉淀比较多，且沉淀的颜色也比较白，蛋白基本就是在表达在包涵体中了。