WB实验翻车无数次？可能从一开始，你的抗体就选错了！

    跑了好几天WB，结果条带上一片空白、背景脏得像地图，或者出现莫名其妙的非特异性条带……别急着怀疑自己，问题很可能出在实验的“源头”——抗体上。今天，我们就来彻底搞懂如何科学地选择一抗和二抗，让你的WB结果从此清晰、特异、可重复！

 

1、核心原理——二者如何协作放大信号

    首先，我们必须清晰地理解一抗和二抗在WB中是如何完美配合的，这是一个三步走的信号放大流程：

    ① 一抗结合抗原： 转移到膜上的目标蛋白（抗原）被其特异性“钥匙”——一抗识别并牢固结合。

    ② 二抗结合一抗： 携带了标记物（如HRP）的二抗，作为“信号兵”，会去寻找并结合一抗，形成“目标蛋白-一抗-二抗”的复合物。

    ③ 信号检测： 最后，通过二抗上的标记物（如HRP酶催化底物发光）实现目标蛋白的可视化与检测。

项目	一抗	二抗
定义	直接结合目标抗原的抗体，是第一层识别工具	结合一抗的抗体，用于放大信号
来源	动物免疫或基因工程制备	动物免疫制备，针对一抗的特定区段
特异性	高，针对特定抗原表位	高，针对一抗的特定位点
应用	直接检测目标抗原，如免疫组化、免疫印迹	放大一抗信号，增强检测灵敏度
优点	直接针对目标抗原，操作相对简单	提高检测灵敏度
缺点	信号较弱，可能需要二抗辅助	需与一抗匹配，增加操作步骤
常见类型	兔源、鼠源、羊源等	抗兔、抗鼠、抗羊等
检测方法	可直接与标记物（如酶、荧光素）结合	通过与标记物结合的二抗进行检测

 

下面，我们就来深入剖析一抗和二抗各自的作用与选择要点。

2、一抗的作用

    一抗是直接识别并结合我们目标蛋白的“特异性钥匙”。它的核心作用：

    ① 特异性结合目标蛋白： 一抗能够与目标蛋白上的特定抗原表位高特异性、高亲和力地结合，从而从复杂的蛋白质混合物中精准地“锁定”目标。

    ② 作为检测的桥梁： 一抗与目标蛋白结合后，其本身又成为二抗的“靶子”，为后续的信号放大提供了不可或缺的结合位点。

    因此，选对一抗是实验成功的根本。你必须考察这6大核心要素：

 

01、目标蛋白信息

    ❖蛋白名称/ID： 最基础的信息，确保你输入的是官方基因符号（如 GAPDH，而不是 Gapdh）。

    ❖物种反应性：这是重中之重！你检测的是人、小鼠、大鼠还是其他物种的蛋白？一定要确保一抗说明书上明确列出了你的实验物种。检测小鼠蛋白，用了抗人的抗体，结果必然是阴性。

    ❖应用类型：务必确认该抗体经过Western Blot (WB) 验证。很多抗体设计用于免疫组化（IHC）或流式（Flow Cytometry），其识别的是天然构象的表位，而WB是变性蛋白，表位可能已被破坏，不通用。

 

02、抗体类型——单抗 vs. 多抗

单克隆抗体： 由单一B细胞克隆产生，只识别单一、特定的表位。

    优点：特异性高，批次间差异小，背景干净。

    缺点：如果目标表位在变性过程中被破坏，可能导致信号丢失。

    适用：检测特定异构体或磷酸化位点，要求高特异性的实验。

多克隆抗体：由多个B细胞克隆产生，是识别多个不同表位的抗体混合物。

    优点：亲和力高，信号强，即使某个表位被破坏，其他表位仍可结合。

    缺点：潜在的非特异性结合风险较高，批次间可能存在差异。

    适用：检测变性蛋白、低丰度蛋白，或希望信号更强时。

 

03、验证数据

    一定要仔细查看供应商官网提供的WB验证数据！

    正确的分子量：条带位置是否在预期分子量大小附近？（注意，蛋白迁移可能会因修饰而偏移）

    敲除/敲低验证： 最有力的证据！在目标基因被敲除（KO）或敲低（KD）的细胞系中，条带是否消失？这是证明抗体特异性的“金标准”。

    特异性条带：是否只有一条主带？如果出现多条带，需要判断是否为异构体、降解产物或非特异性结合。

 

04、样本类型

你的样本是总蛋白裂解液，还是膜蛋白、核蛋白？有些抗体对特定的样本制备方式更敏感，查阅说明书看是否有相关建议。

 

05、推荐的稀释比例

说明书给出的稀释比例是重要的起始参考点。但请记住，这需要在你自己的实验系统中进行优化（通常做1:500, 1:1000, 1:2000的梯度测试）。

 

06、品牌与口碑

    选择知名品牌（如 CST, Abcam, Sigma, Santa Cruz等）通常意味着更严格的质量控制和更详尽的验证数据。多看看文献和同行用的什么，口碑是重要的参考。

 

3、信号的“放大器”——二抗

    二抗是携带检测标签、并能特异性结合一抗的“信号兵”。它的核心作用至关重要：

    ① 检测一抗-抗原复合物： 二抗是针对一抗的抗体，能够与一抗的Fc段结合，从而实现对“目标蛋白-一抗”复合物的间接检测。

    ② 放大检测信号： 二抗通常带有酶标记（如HRP）或荧光标记。由于一个一抗分子可以结合多个二抗分子，而每个二抗分子上的标记物又能产生极强的信号（如HRP的化学发光），这使得信号被极大地放大，从而能够检测到低丰度的目标蛋白。

    ③ 提高检测的灵敏度和准确性： 使用经过特殊处理的高质量二抗，可以有效减少背景噪音，使结果更加准确可靠。

 

选择二抗，抓住这3个关键点：

01、针对一抗的宿主物种

    这是最基本的原则。如果你的一抗是小鼠来源的，那么就需要选择抗小鼠的二抗；一抗是兔来源的，就选抗兔的二抗。千万别搞错！

 

02、标记物类型

    化学发光法（WB）：选择HRP标记二抗，配合ECL显色液。

    荧光法（IF/IHC-F）：选择与实验设备匹配的荧光素（如Alexa Fluor 488、Cy3）。

    多色标记：需选择不同荧光素的二抗（如FITC绿色、TRITC红色），避免光谱重叠。

 

03、交叉吸附

    这是一个高级技巧，能显著降低背景！

    选择经过交叉吸附处理的二抗。这意味着二抗在纯化过程中，已经去除了可能与你样本中其他免疫球蛋白交叉反应的成分。例如，你的样本是小鼠组织，二抗是抗兔的，选择经过“抗小鼠血清交叉吸附”的二抗，可以避免二抗与样本中的小鼠免疫球蛋白非特异性结合，从而获得更干净的背景。

 

4、实战避坑指南 & 优化技巧

01、常见问题

信号弱或无信号：

    可能原因：一抗/二抗浓度过低、二抗种属不匹配、抗体失活、曝光时间过短。

    解决：优化一抗稀释比例，验证二抗种属匹配性，检查标记物活性。

背景高或非特异性条带：

    可能原因：一抗/二抗浓度过高、封闭不充分、洗涤不彻底、膜干燥。

    解决：降低抗体浓度，延长封闭时间并使用合适的封闭剂（5% BSA或脱脂牛奶），增加洗涤次数和体积，确保膜始终湿润。

 

02、抗体稀释与保存

稀释液：

    一抗稀释液：500mL TBS/TBST 5gBSA（牛血清蛋白） 500μL proclean（抑菌防腐剂） 比例 1：2000～3000

    二抗稀释液： PBST/TBST+5%BSA（牛血清白蛋白） 比例 1：5000～60000 （Tween-20可以帮助稀释的二抗均匀分散，并提高其与目标蛋白的结合。 BSA可以作为阻断剂，降低非特异性结合，提高实验的特异性。）

    保存：严格按照说明书保存！反复冻融会使抗体失活。根据使用频率进行分装，-20℃保存。常用工作液可4℃短期存放。

 

03、核心优化技巧

    设置对照：每次实验都必须设置阳性对照和阴性对照（如KO/KD样本），这是判断结果可靠性的基石。

    孵育条件：一抗4℃摇床过夜孵育效果通常更好更稳定。二抗室温孵育1小时即可。

    洗膜是关键：使用足够的TBST，充分洗膜（3次，每次5-10分钟），能有效洗去非特异性结合的抗体，是获得干净背景的廉价而有效的方法。

    内参抗体：选择与目标蛋白分子量相差较大的内参抗体，便于在同一张膜上裁开同时孵育。