基因调控 - 双荧光素酶检测实验

    研究基因调控对于揭示生物体内复杂生命活动的调节机制至关重要。了解基因如何被调控，对于理解发育、疾病发生和治疗等方面具有重大意义。基因调控研究依赖于多种实验技术，其中，双荧光素酶报告基因实验是一项重要的工具。

    通过构建含有荧光素酶报告基因的表达载体，研究者能够观察基因调控因子对荧光素酶活性的影响，实现实时、定量的基因表达监测。这项技术的独特之处在于其高度灵敏性和快速响应性，使得研究者能够准确地探究基因的表达水平和调控机制，为新药研发和疾病治疗提供了有力支持。下面让我们一起来深入了解这一引人注目的技术——双荧光素酶报告基因实验。
 

一、技术简介

    • 双荧光素酶检测是转录调控研究中十分重要的实验手段，主要应用于启动子和转录因子，以及miRNA和其靶基因互作的验证。

    • 在双荧光素酶检测中，将萤火虫荧光素酶作为实验报告基因，海肾荧光素酶作为对照报告基因。实验报告基因用于测试实验条件下基因的表达，而对照报告基因作为内对照。

    • 以荧光素为底物来检测萤火虫荧光素酶活性，荧光素酶可以催化荧光素，在荧光素氧化的过程中会发出生物荧光，然后通过化学发光仪测定。
 

二、原理简介

1.转录因子与启动子
 

 

    将启动子序列构建到萤火虫荧光素酶基因前，同时过表达转录因子。当转录因子与启动子上特异结合位点结合后激活荧光素酶基因转录，使萤火虫荧光素酶得以表达，最终荧光强度上升；当结合位点被突变后，转录因子无法与启动子结合，因此荧光值无明显变化。

 

2.miRNA与靶基因
 

 

    将靶基因序列构建到萤火虫荧光素酶基因3'区域，同时过表达microRNA。当microRNA与靶基因上特异结合位点结合后，将干扰荧光素酶mRNA的翻译或导致其迅速降解，使荧光强度降低；当结合位点被突变后，microRNA无法与靶基因结合，因此荧光值无明显变化。

 

 

三、实验流程

    1、确认miRNA和靶基因相关信息，或者软件预测miRNA和靶基因结合位点

    2、基因合成靶基因3'UTR序列或者突变位点，将该片段构建到萤火虫报告基因载体，测序验证

    3、基因合成pre-miRNA序列，将该片段构建到CDNA3.1载体，测序验证。或使用合成的mimic进行实验

    4、将报告基因质粒转录因子与pre-miRNA表达质粒共转染目标细胞 （建议使用293T细胞进行实验，因为细胞种类会极大影响培养和转染难度）

    5、裂解细胞提取蛋白并用于荧光素酶检测

    6、加入酶作用底物，化学发光仪测定荧光素酶的活性

    7、数据计算及结果分析（实验组荧光强度低于对照组即为阳性结果）
 

四、常见问题及解析

    问题1：在双荧光素酶报告基因实验中，为什么我的荧光信号弱，无法检测到有效的结果？

    解决方案：这可能是由于底物浓度不足或酶反应时间过短所致。建议增加底物的浓度或者延长酶反应时间，确保足够的信号被产生。

 

    问题2：为什么我的背景荧光信号过高，影响了实验结果的准确性？

    解决方案：高背景信号可能是由于试剂或底物受到污染所致。请确保在实验操作中使用无菌和纯净的试剂，并尽量避免交叉污染。此外，优化底物的浓度和酶反应时间也可以帮助降低背景信号。

 

    问题3：在实验中，为什么观察到的荧光信号不稳定，波动较大？

    解决方案：荧光信号的不稳定性可能与温度、光照条件或仪器设置有关。请确保在实验过程中保持恒定的温度和光照条件，并校准实验仪器以确保准确的信号读数。

 

    问题4：我在实验中使用的底物浓度很高，为什么荧光信号仍然不够强？

    解决方案：荧光信号不足可能是由于底物的降解或酶的失活所致。建议检查底物的新鲜度并避免长时间的储存。另外，可以尝试使用更稳定的酶或者增加酶的浓度来提高信号强度。

 

    问题5：在双荧光素酶报告基因实验中，如何避免样本之间的批次效应？

    解决方案：为了避免批次效应，建议在实验中使用相同批次的试剂和底物。同时，保持实验条件的一致性，包括操作者、实验仪器和操作步骤，也是非常重要的。定期进行质控实验，确保数据的可靠性和稳定性。
 

五、金开瑞近期合作案例展示

发表期刊：International Journal of Nanomedicine

影响因子：8

合作技术：双荧光素酶报告基因