沙漠人参新解｜《J Nanobiotechnology》：肉苁蓉外泌体样纳米囊泡靶向支持细胞 p21 通路，修复睾丸损伤新机制

男性不育约占所有不孕病例的50%，主要表现为少精症、弱精症和无精症等精子质量异常。睾丸作为精子发生和雄激素产生的核心器官，极易受到化疗药物、环境毒素和生理应激等因素的损伤，导致生精功能受损。环磷酰胺（CP）作为常用化疗药物，其诱导的睾丸损伤是临床上男性生育力下降的重要原因之一。然而，当前针对睾丸损伤的治疗干预手段仍十分有限，主要依赖经验性抗氧化剂或激素干预，无法精准靶向底层的细胞功能障碍，疗效常不尽如人意。

肉苁蓉（Cistanche deserticola）是珍贵的传统中药材，素有"沙漠人参"之称，长期以来在亚洲国家被传统用于"补肾益精"，经验性地应用于男性生殖疾病的治疗。尽管其小分子成分（如苯乙醇总苷类）的生殖保护效应已得到初步药理学证实，但受限于生物利用度低等瓶颈，临床转化与现代制剂开发面临挑战。更重要的是，肉苁蓉中纳米囊泡组分的治疗潜力此前完全未知。植物外泌体样纳米囊泡因携带蛋白质、脂质、核酸及小分子，具跨物种递送活性分子的优势，在多种疾病模型中显示治疗前景，但在男性生殖保护领域尚属空白。

2026年8月，北京大学屠鹏飞/姜勇/张笑团队在 《J Nanobiotechnology》 发表题为"Plant-derived exosome-like nanovesicles alleviate testicular injury by suppressing p21-mediated cell cycle arrest in Sertoli cells"的研究论文。该研究首次从肉苁蓉中提取外泌体样纳米囊泡（CDELNs），发现CDELNs能够通过其携带的miR-159b-3p靶向抑制睾丸支持细胞中的Cdkn1a/p21，从而缓解细胞周期停滞、修复血睾屏障损伤，并在化疗诱导的睾丸损伤小鼠模型中显著改善精子质量和部分恢复生育能力，为男性不育症的治疗提供了一种有前景的天然纳米策略。

核心发现：CDELNs通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）介导的内吞作用优先被睾丸支持细胞内化，随后CDELNs来源的miR-159b-3p直接靶向Cdkn1a mRNA的3'UTR，导致p21下调，进而减轻支持细胞中p21介导的G2/M期细胞周期停滞。在睾丸损伤小鼠模型中，给予CDELNs显著改善睾丸组织病理学，恢复血睾屏障完整性，提高精液质量和关键激素水平，并部分恢复生育能力。对公开的非梗阻性无精子症（NOA）患者单细胞RNA-seq数据的重新分析显示，支持细胞中CDKN1A表达升高，提示p21失调也可能导致人类睾丸功能障碍。

一、研究创新点

➤填补领域空白：首次将植物外泌体样纳米囊泡（PELNs）应用于男性生殖保护，拓展了PELNs的应用边界。

➤发现新型药效物质：首次系统鉴定并验证CDELNs为肉苁蓉中独立于小分子之外的纳米级活性组分，为传统“补肾”功效提供了新的物质基础与作用视角。

➤阐明新机制：系统揭示了CDELNs来源的miR-159b-3p通过靶向p21/CDK1轴，精准调控支持细胞周期的完整分子通路，确立了p21作为睾丸损伤修复的关键功能节点。

➤提供转化依据：结合NOA患者单细胞数据，表明 CDKN1A 上调是多种 NOA 亚型支持细胞的共同特征，为CDELNs的临床转化提供了重要支撑。

 

二、主要研究内容

 01、分离表征：肉苁蓉 CDELNs 的理化与细胞摄取特征

研究人员采用差速离心结合蔗糖密度梯度离心法，从新疆吐鲁番荒漠肉苁蓉新鲜肉质茎中分离纯化得到 CDELNs。

理化表征显示，CDELNs 呈球形囊泡，平均粒径 168.6 nm，Zeta 电位‑28.7 mV，PDI＜0.2，粒径分布均一、胶体稳定性良好；纳米流式检测纯度＞80%，多批次可稳定制备，重复性佳。

有意思的是，肉苁蓉传统标志性活性成分苯乙醇苷类在 CDELNs 中含量极低（峰面积占比仅 0.03%），囊泡主要小分子组分为甜菜碱、苹果酸、胆碱；团队同时通过脂质组、蛋白组、转录组解析了 CDELNs 的分子货物谱。

细胞摄取实验表明，CDELNs 对睾丸 TM4 支持细胞存在摄取偏好。囊泡通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）介导的能量依赖性内吞入胞：肝素干预、HSPG2 敲低或 4℃低温环境，均可显著抑制囊泡内化。

稳定性结果显示CDELNs 在 PBS 和模拟体液（SBF）中 48 h 内粒径稳定，在模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）中 24 h 内保持稳定，为后续口服给药的研发提供了可能性。

图1. CDELNs的制备过程及表征。包括制备流程示意图、TEM形态观察、粒径分布、Zeta电位、PDI、小分子代谢物和脂质组学分析，以及蛋白质和mRNA的GO/KEGG富集分析。

 

 02 、机制拆解：miR‑159b‑3p/p21/CDK1 调控轴解析

为锁定 CDELNs 起效的关键活性组分，研究开展组分剥离实验。高温变性囊泡内蛋白（囊泡结构仍完整）后，保护活性不变；囊泡高丰度小分子甜菜碱、苹果酸、胆碱也无保护效果。RNase 处理完整囊泡药效保留，裂解囊泡后再酶处理则活性消失，证明囊泡内部包裹的 RNA 是核心起效物质。

提取的总 RNA、miRNA 均可复刻囊泡的细胞保护作用。小 RNA 测序筛选得到 32 个高丰度 miRNA，CDELNs 处理后细胞内 miR‑159b‑3p、miR‑6300 显著上调，功能实验确认miR‑159b‑3p 为缓解 G2/M 周期阻滞的核心 miRNA。

双荧光素酶实验证实，miR‑159b‑3p 直接靶向Cdkn1a mRNA 的 3'‑UTR，促使其降解，下调 p21 蛋白。p21 作为周期抑制蛋白，可抑制 CDK1 活性；4-HC 损伤模型中，Cdkn1a/p21 上调介导 G2/M 周期阻滞；同时 4-HC 还引起 ROS 蓄积与 DNA 损伤。CDELNs 干预能够下调 p21，恢复 CDK1 的 Thr161 位点磷酸化，缓解细胞损伤。

正反功能验证进一步佐证靶点关系：过表达 p21 会抵消 CDELNs 保护效应；siRNA 敲低Cdkn1a，则可重现囊泡的保护表型，改善细胞活力与细胞周期。

由此梳理出完整作用通路：

CDELNs 被支持细胞摄取 → 释放 miR‑159b‑3p → 靶向降解Cdkn1a mRNA、下调 p21 → 解除 p21 对 CDK1 的抑制 → 恢复 CDK1 活性，缓解 G2/M 细胞周期阻滞。

图2. CDELNs通过miR-159b-3p/p21轴改善支持细胞损伤。包括Cdkn1a表达检测、双荧光素酶报告实验、miR-159b-3p功能获得与缺失实验、p21免疫荧光、CDK1/p-CDK1 Western blot分析。

 

 03、体内药效：CDELNs 改善环磷酰胺诱导小鼠睾丸损伤，部分恢复生育能力

研究采用腹腔注射环磷酰胺（CP）构建小鼠睾丸损伤模型，用来模拟化疗带来的生殖毒性。荧光示踪结果显示，腹腔注射 CDELNs 后，囊泡可以进入血液循环，并在睾丸组织明显富集；组织共定位提示，体内 CDELNs 也主要被睾丸支持细胞摄取。

给药干预之后，动物实验得到一系列积极结果：

➤组织病理层面：CDELNs 能够缓解环磷酰胺带来的睾丸萎缩，改善曲细精管结构紊乱、生精上皮变薄、生精细胞耗竭等病理改变；修复血‑睾屏障关键紧密连接蛋白 ZO‑1 的表达与定位。伊文思蓝渗漏实验、透射电镜超微结构观察共同证实，CDELNs 可以恢复血‑睾屏障的完整性。

➤分子机制层面：睾丸组织转录组 KEGG 富集显示细胞周期通路显著变化；Western blot、qPCR 和免疫荧光一致证实 CDELNs 可逆转 CP 诱导的 p21 上调，并恢复 CDK1 磷酸化水平；GATA4 共定位进一步确认 p21 变化发生在支持细胞中。

➤精液与内分泌指标：CDELNs 显著提升精子浓度，并在精子总活力和前向运动活力方面优于阳性对照丙酸睾酮；同时回升睾酮、促性腺激素释放激素、促黄体生成素、促卵泡生成素等关键生殖激素水平。

➤生育力评价：环磷酰胺造模组小鼠完全丧失生育能力；丙酸睾酮处理无法恢复生育。低、高剂量 CDELNs 干预组可以部分恢复小鼠受孕能力，达到 16.7% 受孕率，可产下存活子代。

值得注意的是，虽然生育能力得到部分挽回，但精子 DNA 碎片指数（DFI）仅从 50% 下降至 30%，没有恢复至正常水平；同时模型小鼠的附睾指数也未能被 CDELNs 修复。这也解释了为什么生育力只能部分恢复，无法完全回到正常对照组水平。将给药周期拉长覆盖小鼠完整生精周期，依旧可以观察到 CDELNs 的保护效果。

图 3. CDELNs 改善 CP 诱导的小鼠睾丸损伤。包括实验设计示意图、睾丸系数、精子浓度和活力、血清激素水平、睾丸 H&E 染色、ZO-1 免疫荧光。

 

生物安全性评价

该研究完成了系统的体内外安全性评估。体外溶血实验显示，CDELNs 没有溶血风险。连续 14 天、28 天腹腔注射 CDELNs（2.5 mg/kg/d），小鼠体重增长正常；肝肾功能、血常规相关指标无明显异常；心、肝、脾、肺、肾、睾丸主要脏器组织切片未见病理损伤；生殖相关的睾丸系数、精子参数也未出现不良改变。 在本实验给药条件下，CDELNs 表现出良好的初步生物安全性。

 

 04、临床转化启示：NOA 患者数据集提示 p21 通路具备潜在临床价值

非梗阻性无精子症（NOA）是临床最为严重的男性不育类型，包含克氏综合征、AZFa 微缺失、特发性 NOA 等亚型。

为探究小鼠得到的结论是否和人类疾病存在关联，作者重新解析公开的 NOA 患者睾丸单细胞 RNA 测序数据集。分析结果发现：对比健康人群，NOA 患者睾丸支持细胞当中 Cdkn1A（p21 编码基因）表达普遍上调，其中特发性 NOA 上调最为突出。

这提示，p21 通路异常上调，并非仅仅是药物诱导小鼠损伤模型的特有现象，也参与人类非梗阻性无精子症的病理过程。靶向 p21 的干预策略，具备向临床生殖医学转化的潜在价值。

图 4. CDELNs 通过抑制支持细胞 p21 表达缓解睾丸损伤。包括转录组 KEGG 通路富集、Cdkn1a/p21 表达检测、CDK1/p-CDK1 免疫荧光、以及 NOA 患者支持细胞 CDKN1A 单细胞表达分析。

 

三、核心结果总结

研究维度	核心发现
CDELNs特征	粒径约168.6 nm，Zeta电位-28.7 mV，PDI<0.2；富含甘油酯、甘油磷脂和脂肪酰基；苯乙醇总苷含量极低（0.03%），主要小分子为甜菜碱（26.9%）、苹果酸（11.62%）、胆碱（6.63%）
细胞摄取机制	通过HSPG介导的内吞作用优先被支持细胞（TM4）内化，4°C低温和HSPG2敲低均显著抑制摄取；PBS/SBF 中 48 h 稳定，SGF/SIF 中 24 h 稳定
关键活性成分	miRNA为关键活性组分（蛋白质和小分子代谢物均非主要活性成分）；miR-159b-3p为关键功能miRNA
分子靶点与通路	miR-159b-3p直接靶向Cdkn1a mRNA 3'UTR → p21下调 → CDK1 Thr161磷酸化恢复 → G2/M期阻滞解除
体内疗效	显著改善睾丸组织病理、精子浓度和活力（优于TP）、生殖激素水平（T/GnRH/LH/FSH）、BTB完整性；部分恢复生育力（受孕率16.7%）；DFI从~50%降至~30%
生物安全性	无溶血活性；14天和28天连续给药未见系统毒性、肝肾损伤、血液学异常或生殖毒性
临床转化依据	NOA患者scRNA-seq数据显示CDKN1A在所有NOA亚型支持细胞中显著上调，iNOA中最高，提示p21失调为人类睾丸功能障碍的共同特征

 

四、总结与展望

本研究首次从植物外泌体样纳米囊泡的角度，揭示了传统中药肉苁蓉"补肾益精"功效的现代生物学机制。CDELNs及其携带的miR-159b-3p通过靶向Cdkn1a/p21轴，精准解除支持细胞的细胞周期停滞，修复血睾屏障，改善精子质量和激素水平，并部分恢复生育能力。该研究将传统中医药理论与现代纳米药物研究有机结合，系统揭示了肉苁蓉来源外泌体样纳米囊泡在男性生殖保护方面的药理作用及分子机制，拓展了肉苁蓉传统药效物质基础的研究领域，为天然纳米药物与健康产品开发提供了科学依据。

未来研究需进一步探索以下方向：在原代支持细胞中验证CDELNs的分子机制（本研究主要依赖TM4细胞系）；在慢性或遗传性不育模型中评估CDELNs疗效；优化睾丸靶向递送效率并减少脱靶器官积累；开展长期毒理学和剂量-效应研究以评估植物miRNA潜在的脱靶效应；建立GMP合规的规模化生产工艺以保证囊泡粒径、形态、miRNA装载和生物效力的批次一致性。此外，CDELNs中其他生物活性组分（如甘油酯、N-乙酰乙醇胺等代谢物）对睾丸微环境代谢重编程的潜在贡献也值得深入探索。

 

参考文献：Xiao Y, Hou X, Wei C, et al. Plant-derived exosome-like nanovesicles alleviate testicular injury by suppressing p21-mediated cell cycle arrest in Sertoli cells. J Nanobiotechnol. 2026. https://doi.org/10.1186/s12951-026-04871-8