科研人必看！酵母双杂交筛库全流程拆解

    酵母杂交系统作为研究蛋白质互作及基因调控网络的重要工具，其应用广泛性与技术可靠性已在分子生物学领域得到充分验证。然而，实验设计的科学性与结果的有效性高度依赖于前期对核心问题的清晰界定。在启动酵母筛库实验前，研究者需优先明确两个关键问题：第一，诱饵蛋白的亚细胞定位（细胞核或细胞质/膜）；第二，实验目标为筛选互作蛋白还是调控通路中的上游基因。这两个问题的答案将直接影响文库体系与杂交技术的选择，从而决定筛库实验的成败。

    针对诱饵蛋白的亚细胞定位，若其定位于细胞核，通常需选择核体系酵母双杂交文库，以确保互作环境与生理条件一致；而定位在细胞质或膜系统的诱饵蛋白，则需采用膜体系酵母双杂交文库，以兼容跨膜蛋白或膜相关蛋白的特殊互作需求。进一步地，实验目标若为筛选直接互作蛋白，双杂交系统（Y2H）因其依赖“诱饵-猎物”蛋白的直接结合特性，成为首选方案；若需挖掘上游调控基因（如转录因子结合靶基因），则需依赖酵母单杂交系统（Y1H），通过DNA-蛋白互作机制实现目标筛选。

 

一、酵母单杂和双杂区别

酵母单杂和酵母双杂二者有所区别

Y1H：聚焦DNA-蛋白互作，用于解析基因调控（如：谁在调控我的基因？）。

Y2H：聚焦蛋白-蛋白互作，用于构建互作网络（如：我的蛋白和谁结合？）。

对比维度	酵母单杂筛库（Y1H）	酵母双杂筛库（Y2H）
诱饵载体	包含目标DNA序列（如启动子、顺式作用元件），需克隆至报告基因上游。	包含诱饵蛋白，需与转录因子的DNA结合结构域（如Gal4-BD）融合。
筛选目标	筛选能够结合特定DNA序列的DNA结合蛋白（如转录因子、调控蛋白）。	筛选与诱饵蛋白直接发生互作的互作蛋白（如信号通路伴侣、复合体成员）。
功能解析	解析基因调控机制（如“哪些蛋白调控靶基因表达？”）。	揭示蛋白质互作网络（如“靶蛋白与哪些蛋白直接结合？”）。
互补实验	需通过结合特异性验证（如EMSA、荧光素酶报告系统）。	需通过共转化实验或双分子荧光互补（BiFC）等验证互作真实性。
互作类型	DNA-蛋白质相互作用（蛋白结合DNA调控元件）。	蛋白质-蛋白质相互作用（两蛋白直接结合形成功能复合体）。
文库类型	通常为基因组文库或cDNA文库，覆盖潜在DNA结合蛋白。	根据诱饵定位选择： - 核体系文库（核定位诱饵） - 膜体系文库（细胞质/膜定位诱饵）。
报告基因激活条件	DNA结合蛋白与诱饵DNA序列结合后，直接激活报告基因。	诱饵蛋白与猎物蛋白互作后，促使转录因子重构，激活报告基因。
局限性	仅适用于具有DNA结合能力的蛋白；需明确靶基因调控区域。	可能漏筛弱互作或依赖翻译后修饰的互作；需避免诱饵自激活。

 

二、酵母双杂筛库实验流程

1. 诱饵载体构建与自激活检测

（1）诱饵载体转化酵母

    将100ng诱饵重组质粒PGBKT7-A和猎物空载质粒PGADT7共转化（Y2HGold或AH109感受态细胞）。

    酵母感受态制备：接种单菌落于 5mL YPD 培养基，30℃振荡培养至对数生长期（OD600=0.6-0.8），离心收集菌体，用无菌水和 TE/LiAC 溶液洗涤。

    转化体系：酵母感受态50uL + 诱饵质粒100ng +猎物空载（PGADT7）100ng+carrier DNA 5uL+LiAc/PEG 500uL，30℃孵育30min，加160μL DMSO 42℃热激 30min，经过离心收菌和重悬后，诱饵加猎物空载共转化的菌液涂布相应平板DDO、TDO/3’AT、QDO，诱饵单转的菌液涂布平板SD/-Trp，30℃恒温培养4d。

（2）自激活检测

    诱饵质粒PGBKT7-A和猎物空载PGADT7共转化Y2H Gold感受态，涂布DDO平板，能生长说明重组诱饵质粒成功转入宿主菌且对宿主菌无毒性；涂布TDO不长，说明诱饵质粒不能激活报告基因HIS3；涂布QDO不生长，说明诱饵质粒不能激活酵母细胞报告基因的表达ADE2的表达，可以进行下一步筛库实验。

 

2.转化及阳性克隆筛选

    从SD/-Trp平板挑取单克隆菌种接于液体SD/-Trp培养基，再转接于YPDA，振荡培养过夜后离心收菌，用30 mL无菌水重悬菌体再次离心收菌，然后用1.5 mL 0.1M TE/LiA重悬菌体，离心去上清，再用600 ul 0.1M TE/LiAc重悬菌体，混匀后向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀：

感受态	文库质粒	carrier DNA	LiAc/PEG
600 μL	25 μg	20μL	2.5mL

    30℃孵育30min，加160μL DMSO 42℃热激 30min，加3ml YPDA再摇床培养1.5h，经过离心收菌和重悬后，用0.9% NaCl重悬菌体，均匀的涂在TDO /X/3’AT平板，30 ℃培养4-5 d。

 

3. 阳性克隆验证

测序分析：

    阳性克隆菌株分别接入TDO液体培养基，振荡培养过夜后采用酵母小量抽提试剂盒（金开瑞公司）抽提酵母质粒。以抽提得到的酵母质粒为模板，进行PCR扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；扩增有阳性带的样品用通用引物测序，测序结果进行BLAST比对分析。

互作验证：

一对一验证：将候选猎物基因单独克隆至AD载体，重复双杂交验证。

正交实验：Co-IP、Pull-down或荧光互补进一步确认互作。

 

三、常见问题解答

Q、筛选后假阳性率高，如何解决？

A、可能原因：诱饵自激活、非特异性结合或文库污染。
解决方案：提高筛选严格性（如增加3-AT浓度），重复验证阳性克隆。

 

Q、筛选后未获得任何互作克隆?

A、(1)诱饵与猎物无互作
原因：目标蛋白之间确实不存在直接相互作用。
解决：验证已知互作蛋白对是否能在相同条件下激活报告基因。
(2)文库覆盖度不足
原因：文库未包含目标蛋白或目标蛋白丰度过低。
解决：使用均一化文库或提高文库转化效率（≥1×10⁶ CFU）。
实验条件不当
原因：筛选条件过于严格（如3-AT浓度过高）或报告基因灵敏度不足。
优化3-AT浓度梯度测试。
更换高灵敏度报告基因。
(3)蛋白定位错误
原因：诱饵/猎物蛋白未正确进入细胞核。
解决：在载体中加入NLS序列。

 

Q、阳性克隆重复性差？

A、检查酵母菌株的遗传稳定性；
确保筛选条件一致（如培养基成分、温度）。

 

Q、如何区分直接互作与间接互作？

A、酵母双杂交仅检测直接互作，间接互作需结合Co-IP等体外实验验证。

 

Q、初筛阳性克隆在回转化后不显示互作。

A、(1)假阳性干扰，通过多次重复筛选和测序排除非特异性克隆。
(2)质粒丢失或重组，酵母在传代过程中丢失猎物或诱饵质粒。可使用选择性培养基维持质粒稳定性。

    金开瑞提供专业化酵母筛库服务：酵母单杂交筛库、核体系酵母双杂交筛库及膜体系酵母双杂交筛库。通过精准匹配诱饵蛋白特性与实验目标需求，该服务体系可显著提高筛库效率，为功能基因组学研究和复杂分子机制解析提供强有力的技术支撑。