干货分享 | 如何使用ImageJ对WB条带进行灰度值分析

    在分子生物学与细胞生物学的研究领域中，Pull-down 实验和免疫共沉淀（IP）实验作为探索蛋白质相互作用、鉴定蛋白质复合物成分的关键技术，发挥着不可替代的作用。实验的成功仅仅是研究的第一步，如何准确、客观地分析实验结果，从中提取有价值的信息，才是推动研究进展的核心环节。在 Pull-down 和 IP 实验中，蛋白质印迹（Western Blotting，WB）作为检测和鉴定目标蛋白及其相互作用蛋白的“金标准”，其结果往往以数据图的形式呈现。这些数据图直观地反映了不同样品中目标蛋白的表达水平以及相互作用的强度，但仅凭肉眼观察和主观判断难以精确评估蛋白表达量和相互作用程度的差异。因此，对这些 WB 数据图进行量化分析显得尤为重要。ImageJ软件能够满足对 WB 数据图进行量化分析的各种需求，接下来我们就来详细的给大家讲讲如何使用ImageJ软件进行WB条带量化！！！

Image J 的下载地址：https://imagej.net/downloads

步骤1：数据图预处理

    打开Image J软件，点击File菜单，选择open， 选择你的WB图像保存的文件，将图导入。

步骤2：转换为灰度图像

    点击Image-选择Type-然后选择8-bit，目的是要将其转换为灰度图像，图片的每个像素用8bit表示，ImageJ的许多分析工具都是基于灰度图像的。

步骤3：让背景灰度均一化，消除背景影响

    点击Process，然后选择Subtract Background，Light Background是默认选择，默认数值为50即可，也可根据自己的的实际需求进行填写。

步骤4：将图片黑白颜色调换

    菜单栏选择Edit → Invert，让背景变为黑色，条带变为白色。

步骤5：设置参数

    设置各个参数，点击“Analyse”，选择“Set measurement”，勾选如下图几个参数的选项。

步骤6：设置测量单位为“单个像素”

    菜单栏选择Analyze→Set Scale，设置单位，Unit of length→【Pixels】，长度单位选择像素，之后点击OK。

步骤7：分析数据

    点击“Analyse”中的“measure”得到数据（或者使用快捷键Ctrl+M也可直接获得数据），框选的时候，选择矩形工具，椭圆或者其他工具也可以，需要将整个条带进行框选，分析时会弹出Results结果框，结果中的IntDen即积分灰度值；继续重复上述步骤，移动选定框到其他条带进行测量。（注意不要点框线，否则选定框大小会变化，Area 也会随之变化，影响测量结果）。

步骤8：整理数据绘制柱状图

    获得数据后，点击Results框中的Edit，选择Select All选择复制数据，粘贴到新建的Excel表中，得到数据后直接利用Excel或者Prism软件去绘制柱状图即可。