DNA合成的脱保护步骤如何操作？不同保护基团的脱保护条件有何差异？

    DNA化学合成是固相合成，核苷酸的活性基团会被保护，合成完成后需脱除保护基才能得到有活性的完整DNA，操作分固相脱保护和液相脱保护两步，再讲不同保护基团的条件差异。

一、DNA合成的脱保护步骤（固相合成通用流程）

第一步：固相切割脱保护（先把DNA从合成载体上切下来+脱除部分保护基）

    合成好的DNA链通过连接臂固定在固相载体（如CPG载体）上，先进行切割+同步脱保护，核心操作：将固相载体转移至离心管，加入对应切割脱保护试剂，室温或恒温震荡反应，反应结束后离心分离，取上清液（含游离DNA），弃去固相载体；此步骤会同步脱除核苷酸上的部分保护基团，后续需针对性脱除剩余基团。

 

第二步：针对性脱保护（脱除碱基上的剩余保护基）

    切割后DNA仍有碱基保护基未脱除，需根据保护基类型选择对应试剂和条件反应，全程避光（多数保护基对光敏感），反应完成后终止反应；常见终止方式为中和（碱性脱保护用弱酸中和）、减压浓缩（酸性脱保护）或萃取（有机试剂保护基）。

 

第三步：纯化收尾（去除脱保护试剂和副产物）

    脱保护后DNA含试剂残留和副产物，需纯化处理：常用乙醇沉淀法（加冰冷乙醇+盐离子，离心沉淀DNA），或柱纯化、HPLC纯化；纯化后用超纯水溶解DNA，检测浓度和纯度，完成脱保护全流程。

二、不同保护基团的脱保护条件差异（DNA合成核心3类保护基，差异关键在试剂、温度、时间）

    DNA合成中保护基主要分3类：碱基氨基保护基、5'-羟基保护基、磷酸基团保护基，其中碱基保护基是核心，差异最明显，我们逐一拆解

 

5'-羟基保护基（最基础，合成中循环脱保护，合成后无需额外处理）

    常用保护基：DMT（二甲氧基三苯甲基），是DNA固相合成的标配保护基
脱保护条件：合成过程中每一步偶联前脱除，用3%~5%三氯乙酸（TCA）/二氯甲烷溶液，室温反应30~60秒；脱保护原理是酸性条件下DMT基团被质子化，发生裂解脱落；合成完成后5'-端DMT可选择性保留（用于后续纯化），若需脱除，合成最后一步用TCA处理即可，无需后续额外脱保护，条件温和无损伤。

磷酸基团保护基（合成后需脱除，条件统一温和）

常用保护基：2-氰乙基，适配亚磷酰胺法合成

    脱保护条件：与固相切割同步进行，用浓氨水（28%）或乙胺，室温反应1~2小时即可完全脱除；原理是碱性条件下氰乙基发生β-消除反应脱落，无残留，对DNA无损伤，所有磷酸保护基脱保护条件基本一致，无明显差异，无需区分。

    碱基氨基保护基（核心差异类，分2大体系，条件完全不同，影响DNA活性关键）
碱基上的氨基需保护避免副反应，分两大类保护基，脱保护条件差异极大，是脱保护的核心难点（1）第一类：烷氧羰基类保护基（常用，适配常规DNA合成）代表保护基：Bz（苯甲酰基）（保护A、C碱基）、iBu（异丁酰基）（保护G碱基）脱保护条件：碱性条件脱保护，标配28%浓氨水，反应条件分两种：①室温震荡反应12~16小时（温和，适合短链DNA，无损伤）；②55℃恒温反应1~2小时（高效，适合长链DNA，缩短时间）；原理是碱性条件下氨基上的保护基发生水解，脱落下来；此体系脱保护无需额外中和，后续乙醇沉淀即可去除氨水，操作简单，是主流选择。（2）第二类：苯甲酰亚胺类保护基（适配高难度DNA合成，如高GC、重复序列）代表保护基：Pac（苯乙酰基）、Phenoxyacetyl（苯氧乙酰基）脱保护条件：酸性条件脱保护，常用80%甲酸或三氟乙酸，室温反应30~60分钟；原理是酸性条件下保护基裂解，脱保护后需立即减压浓缩去除甲酸/三氟乙酸，避免酸对DNA链造成断裂；此体系脱保护效率高，适合难合成序列，但酸性条件有潜在损伤，需严格控制时间，避免过度反应。（3）特殊保护基（适配极难合成DNA，条件严苛）代表保护基：FMOC（芴甲氧羰基），保护A/C碱基，适配超长链、高复杂序列

脱保护条件：碱性条件，但需用哌啶/二甲基甲酰胺（DMF）溶液，室温反应5~10分钟；脱保护后需用DMF洗涤去除哌啶，再用氨水切割，步骤比常规体系繁琐，仅用于特殊场景。

注意事项（避免脱保护失败）

    脱保护优先级：先切割+脱磷酸保护基，再脱碱基保护基，顺序不可颠倒，否则会导致DNA链断裂或保护基残留；

    损伤防控：碱性脱保护时间过长、温度过高会导致DNA脱嘌呤，酸性脱保护浓度过高会导致磷酸二酯键断裂，需严格控条件；

    特殊序列适配：高GC序列优先选Bz/iBu体系（碱性温和），避免酸性损伤；超长链DNA可选55℃浓氨水快速脱保护，减少副反应。