实验前，RNA探针需要进行变性复性处理吗？处理条件如何设置？

RNA探针实验前建议做变性复性处理，核心目的是打开探针自身的发夹结构、消除多聚体，让探针单链保持舒展状态，提升杂交特异性和效率；只有极短探针（＜20nt）可酌情省略，原位杂交、Northernblot等核心实验都推荐做。

一、先明确：哪些场景必须做变性复性，哪些可省略

必须做的场景（不做会严重影响结果）

原位杂交（ISH）、荧光原位杂交（FISH）：RNA探针易自身折叠，变性复性是关键预处理

Northernblot：保证探针与靶RNA高效结合，降低背景杂带

长链RNA探针（＞50nt）：长链更易形成二级结构，必须处理

高GC含量探针（GC＞60%）：易自身配对，需变性解开

 

可省略的场景

短链RNA探针（＜20nt）：结构简单，不易折叠

探针合成后立即使用，且储存条件规范（-80℃分装，无反复冻融）

二、RNA探针变性复性标准操作步骤（两步法，全程防降解）

RNA探针易被RNase降解，全程需用无酶耗材、无酶水，操作在冰上或低温环境进行，步骤固定好记

配制探针工作液

    取适量RNA探针（浓度一般10~50ng/μL），用无酶水或杂交缓冲液稀释至工作浓度，避免浓度过高导致聚集

 

变性处理（解开二级结构/多聚体）

    将探针管放入PCR仪或水浴锅，95~100℃恒温加热5~10分钟；温度不能低于95℃，否则无法完全变性；时间不超10分钟，防止RNA降解

 

快速冰浴（关键步骤，防止复性回折）

    加热后立即将探针管转移至冰上静置5~10分钟，必须快速降温，让探针保持单链舒展状态，避免缓慢冷却时重新形成二级结构

 

    温和复性（可选，适配部分实验）

    若探针链较长（＞100nt），冰浴后可放在37℃水浴孵育10~15分钟，让探针单链稳定，既不回折，又能提升后续杂交亲和力；短链探针冰浴后可直接使用，无需此步

 

立即使用或短期存放

    处理后的探针最好立即用于实验；若暂时不用，可放冰上保存1~2小时，严禁反复冻融，否则会重新形成结构

 

三、不同实验场景的变性复性条件微调（精准适配，效果更好）

    标准条件可根据探针和实验类型微调，核心不变（高温变性+快速冰浴）

原位杂交（ISH/FISH）专用条件

    变性：95℃7分钟（兼顾变性彻底和防降解）

​​​​​​​    冰浴：10分钟（确保单链稳定，适配玻片杂交环境）

​​​​​​​    复性：无需额外37℃孵育，冰浴后直接加入杂交液，随杂交体系升温即可

 

Northernblot专用条件

​​​​​​​    变性：100℃5分钟（快速彻底变性，减少长时高温降解）

​​​​​​​    冰浴：5分钟

​​​​​​​    复性：37℃15分钟（提升探针与膜上靶RNA的结合效率）

​​​​​​​    高GC/长链探针（＞150nt）专用条件

​​​​​​​    变性：98℃10分钟（更高温更彻底解开顽固二级结构）

​​​​​​​    冰浴：10分钟

​​​​​​​    复性：42℃20分钟（温和复性，避免回折）

​​​​​​​    低浓度探针（＜10ng/μL）

​​​​​​​    可在变性前加入少量RNA载体（如酵母tRNA），防止探针吸附损耗，变性复性条件不变

 

四、关键注意事项（避坑重点）

​​​​​​​    全程无RNase：耗材需无酶处理，操作戴手套，避免徒手接触，试剂用无酶水配制

​​​​​​​    温度把控：变性温度不能低（＜95℃变性不彻底），不能长时间高温（＞10分钟RNA易断裂）

​​​​​​​    快速冰浴是核心：不能自然冷却，否则探针会快速复性折叠，白做变性

​​​​​​​    避免反复处理：同一探针只做1次变性复性，反复加热会导致RNA降解

​​​​​​​    特殊探针：带修饰的RNA探针（如地高辛标记），变性复性条件与普通探针一致，修饰基团不受影响

 

五、常见问题排查

​​​​​​​    杂交背景高：大概率是变性不彻底，探针自身折叠形成非特异性结合，可延长变性时间至10分钟

​​​​​​​    ​​​​​​​无杂交信号：可能是变性温度过高/时间过长导致探针降解，可降低至95℃5分钟，缩短冰浴后存放时间

​​​​​​​    信号弱：可增加37℃复性步骤，让探针单链更稳定，提升结合效率