qRT-PCR（实时荧光定量PCR）实验原理与数据分析技术详解

    实时荧光定量PCR（quantitative Real-Time PCR，简称qRT-PCR）是一种高灵敏度、高特异性的分子生物学技术，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、转基因鉴定及microRNA研究等领域。其核心在于在PCR扩增过程中实时监测荧光信号的累积，从而实现对起始模板量的精确定量。以下从实验原理、技术类型、操作流程到数据分析方法进行系统详述。

一、实验原理

    qRT-PCR的本质是将传统PCR的终点检测转变为扩增过程中的实时动态监测。DNA聚合酶在每一轮循环中合成新链，若反应体系中加入能与双链DNA结合或序列特异性识别的荧光标记物，则随着产物增加，荧光强度同步增强。仪器通过光学系统实时采集每个循环的荧光值，绘制“扩增曲线”。关键概念包括：

    Ct值（Cycle threshold）：荧光信号超过设定阈值（通常位于指数扩增期）所需的循环数。Ct值与起始模板量呈负相关——模板越多，Ct值越小。

    指数扩增期：理想情况下，前15–30个循环中产物以2倍速率增长（效率≈100%），此阶段的数据用于定量最为可靠。

需注意，“qRT-PCR”常被误用为泛指所有实时定量PCR，严格而言：

    若检测对象是mRNA，需先通过逆转录（Reverse Transcription, RT） 将RNA转为cDNA，再进行qPCR，此时应称 RT-qPCR；

    若直接检测DNA模板（如拷贝数变异），则为 qPCR。

二、荧光检测技术类型

    目前主流有两类荧光化学体系：

    非特异性染料法（如SYBR Green I）

    SYBR Green I可嵌入任何双链DNA的小沟中，发出强荧光。优点是成本低、操作简便；缺点是无法区分特异性产物与引物二聚体或非特异扩增，需通过熔解曲线（Melting Curve）验证产物单一性——单一峰表明扩增特异。

    序列特异性探针法（如TaqMan探针）

    探针是一段与目标序列内部区域互补的寡核苷酸，5'端标记报告荧光基团（如FAM），3'端标记淬灭基团（如TAMRA）。完整时荧光被淬灭；当Taq酶在延伸过程中发挥5'→3'外切酶活性，水解探针，使报告基团释放，产生荧光。该方法特异性高，适用于多重检测（不同探针用不同荧光染料），但成本较高、设计复杂。

 

三、实验操作关键步骤

    样本准备：提取高质量RNA（若做RT-qPCR），避免降解；用DNase处理去除基因组DNA污染。

    逆转录（仅RT-qPCR需要）：使用Oligo(dT)、随机引物或基因特异性引物将RNA反转录为cDNA。

    引物/探针设计：跨内含子设计以避免gDNA扩增；产物长度80–200 bp为宜；Tm值58–62°C；避免二聚体和发夹结构。

    反应体系配置：包含模板cDNA/DNA、引物（或引物+探针）、dNTPs、热稳定DNA聚合酶、缓冲液及荧光染料。

    运行程序：通常包括预变性（95°C, 2–10 min），随后40–45个循环的变性（95°C, 10–15 s）—退火/延伸（60°C, 30–60 s），部分仪器合并后两步。

    熔解曲线分析（SYBR Green法必需）：从60°C缓慢升温至95°C，监测荧光下降，确认单一产物。

 

四、数据分析技术

    定量分析的核心是相对定量或绝对定量。

（1）绝对定量

    需构建标准曲线：用已知浓度的模板（如质粒、体外转录RNA）进行系列稀释（如10⁷–10¹ copies），测定各稀释点的Ct值，绘制“log(起始量) vs Ct”标准曲线。待测样本的Ct值代入方程即可计算其绝对拷贝数。适用于病毒载量、转基因拷贝数等场景。

 

（2）相对定量（更常用）

    用于比较不同样本间某基因的表达差异，无需标准品，常用ΔΔCt法：

    首先，用内参基因（如GAPDH、β-actin、18S rRNA）校正样本间加样误差：ΔCt = Ct目标基因 – Ct内参基因

    然后，选择一个对照组（如未处理组）作为基准，计算ΔΔCt = ΔCt实验组 – ΔCt对照组

    最终相对表达量 = 2–ΔΔCt（假设扩增效率为100%）

    若扩增效率（E）偏离100%（如90%–110%），需用修正公式：相对表达量 = (1 + E)目标–ΔCt目标 / (1 + E)内参–ΔCt内参

 

（3）扩增效率验证

通过梯度稀释模板，计算斜率（Slope）：E = 10(–1/Slope) – 1。理想斜率为–3.32，对应E=100%。效率应在90%–110%之间，R² > 0.99。

 

（4）数据可视化与统计

    结果通常以柱状图展示相对表达倍数，并辅以误差线（SD或SEM）；组间比较采用t检验或ANOVA，p < 0.05视为显著差异。

 

五、注意事项与常见问题

    内参基因稳定性：必须在实验条件下表达恒定，建议用GeNorm或NormFinder软件筛选最佳内参。

    无模板对照（NTC）：监控污染；无逆转录对照（–RT）：排除gDNA干扰。

    技术重复：每个样本至少3次重复，减少操作误差。

    引物特异性：电泳或测序验证PCR产物。

    qRT-PCR凭借其高灵敏度、宽动态范围和良好重复性，仍是基因表达分析的“金标准”。然而，其准确性高度依赖于严谨的实验设计、规范的操作流程和科学的数据处理。只有在充分理解原理并严格控制变量的前提下，才能获得可靠、可重复的定量结果，为后续生物学解释提供坚实依据。