EMSA凝胶电泳迁移实验的迁移率的影响因素有哪些?

    凝胶电泳迁移实验（如琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳）中，分子（通常是DNA、RNA或蛋白质）在电场作用下的迁移率（mobility）受多种因素影响。以下是主要的影响因素：

 

1. 分子大小（分子量）

    DNA/RNA：在非变性条件下，较小的核酸片段迁移更快；迁移率大致与分子量的对数成反比。

    蛋白质：在SDS-PAGE中，SDS使蛋白质带负电并线性化，迁移率主要取决于分子量。

 

2. 分子构型（对核酸而言）

    超螺旋、开环和线性DNA即使分子量相同，迁移速率也不同：

    超螺旋 > 线性 > 开环（在常规琼脂糖凝胶中）。

    构象影响分子在凝胶孔隙中的通过能力。

3. 凝胶浓度（孔径大小）

    凝胶浓度越高，孔径越小，对大分子的阻碍越大。

    琼脂糖凝胶常用浓度：0.5%–2%，适合分离较大DNA（0.2–20 kb）。

    聚丙烯酰胺凝胶浓度更高（5%–20%），适合分离小片段或蛋白质。

 

4. 电场强度（电压）

    电压越高，迁移速度越快，但过高会导致：

        条带弥散（热效应）

        分辨率下降

        DNA可能变性或凝胶熔化（尤其低熔点琼脂糖）

 

5. 缓冲液组成与离子强度

    常用缓冲液：TAE、TBE（用于核酸）；Tris-Glycine（用于蛋白质）。

    缓冲液影响：

        pH值（决定分子所带电荷）

        离子强度（过高会降低迁移率并产热；过低则导电性差）

 

6. 分子所带净电荷

    对于蛋白质尤其重要（天然PAGE中）：

        电荷越多，迁移越快。

        在SDS-PAGE中，SDS掩盖了原有电荷差异，使迁移仅依赖分子量。

 

7. 温度

    温度升高会：

        降低缓冲液黏度，略微加快迁移

        但可能引起凝胶变形、条带拖尾或样品降解

    通常在低温或室温下进行，高电压时需冷却

 

8. 染料或添加剂

    如溴化乙锭（EB）可嵌入DNA，轻微改变其构象和迁移率。

    上样缓冲液中的甘油或蔗糖增加样品密度，不影响迁移率本身，但影响上样效果。

 

    迁移率 = f(分子大小, 构型, 凝胶浓度, 电场强度, 缓冲系统, 电荷, 温度)

    在实验设计中，需根据目标分子特性选择合适的凝胶类型、浓度、缓冲体系和电压条件，以获得最佳分辨率和重复性。