体外RNA合成如何保证RNA的完整性，避免降解和二级结构形成？

    体外RNA合成（如T7/T3/SP6聚合酶介导的转录）中，RNA完整性的核心威胁来自两方面：一是RNase降解（RNA酶无处不在且耐高温，易导致链断裂），二是RNA二级结构（碱基互补配对形成的茎环、发夹等，影响转录效率、产物均一性及后续应用）。以下从“防降解”“抑二级结构”“质量控制”三个维度，系统梳理关键技术策略和操作细节：

一、核心目标：明确“RNA完整性”的定义

体外合成的RNA需满足两个核心指标：

    一级结构完整：无核苷酸缺失、断裂，全长产物占比≥90%（无明显降解条带）；
    二级结构可控：避免形成稳定的异常二级结构（如过长茎环、多分支结构），或可通过后续处理解除，确保RNA功能（如翻译、转染、qPCR标准品等）。

二、策略1：严防RNase降解，守住“一级结构完整”的底线
    RNase（RNA酶）是体外RNA合成的头号“敌人”——广泛存在于皮肤、唾液、实验耗材中，且耐煮沸、耐高压，一旦污染即导致RNA断裂。需从“环境、耗材、试剂、操作”全流程控酶：

 

1.实验环境与耗材：彻底去除RNase

    专用区域：设立RNA实验专属工作台（避免与DNA实验交叉污染），定期用RNase灭活剂（如RNaseZap、0.1%DEPC水）擦拭台面、移液器、离心机内壁。
耗材处理：

    优先使用RNase-free预装耗材（离心管、吸头，包装标注“RNase-free”），无需自行处理；

    若需自制：玻璃器皿180℃干烤4小时以上，塑料耗材用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液浸泡过夜，再高压灭菌（121℃，20分钟）去除DEPC（DEPC有毒，需通风操作）。

    水的纯度：全程使用RNase-free超纯水（可直接购买，或用DEPC处理水再经0.22μm滤膜过滤），避免水中RNase污染。

 

2.试剂制备：无RNase污染是关键

    核心试剂（ATP、UTP、CTP、GTP、T7聚合酶、缓冲液、DTT等）需购买“RNase-free级”，开封后分装冻存（避免反复冻融导致酶活性下降或RNase释放）。

    避免使用含RNase的试剂：如普通TAE/TBE缓冲液（可配制RNase-free版本）、未经处理的甘油等。

    转录体系中可添加RNase抑制剂（如RNasin、MurineRNaseInhibitor）：需选择与转录条件兼容的抑制剂（如T7聚合酶转录温度为37-42℃，需用耐高温的RNase抑制剂，避免低温抑制剂失活），终浓度通常为0.5-1U/μL，直接抑制体系中可能残留的RNase。

 

3.操作细节：减少人为污染

    实验前用RNase-free手套（避免皮肤接触耗材/试剂），手套定期更换（接触非RNA实验物品后需换）；

    禁止在RNA实验区域饮食、说话（唾液中含RNase）；

    试剂分装时使用RNase-free吸头和离心管，避免反复开盖导致污染；

    转录反应结束后，若需后续纯化（如去除模板DNA、NTP），需快速处理，避免RNA暴露在RNase环境中过久。

 

4.转录后处理：去除潜在RNase

    转录产物纯化优先选择RNase-free的纯化试剂盒（如硅胶柱法、磁珠法），避免使用酚/氯仿抽提（酚易残留，且需额外注意RNase污染）；

    纯化后的RNA溶解于RNase-free水或无RNase的缓冲液（如10mMTris-HCl,pH7.5），避免用含EDTA的缓冲液（可能影响后续酶促反应，如翻译、逆转录）。

 

三、策略2：抑制/调控RNA二级结构，保证产物均一性

    RNA二级结构由碱基间互补配对（A-U、G-C、G-Uwobble配对）形成，其稳定性与RNA序列、温度、离子强度密切相关。二级结构会导致：

    ①转录停滞（聚合酶无法通过茎环结构，产生截短产物）；

    ②产物异质性（同一RNA分子形成不同构象）；

    ③后续应用受阻（如翻译时核糖体无法结合，转染效率下降）。核心策略是“从源头设计+反应条件优化+转录后解旋”：

 

1.序列设计：从源头减少稳定二级结构

    避免连续互补序列：设计模板DNA时，避免RNA序列中出现≥8个连续的互补碱基（如AAAAAAAU与UUUUUUUA配对，易形成长茎结构），尤其是在转录起始区（前10个核苷酸），避免形成“起始茎环”导致转录失败；

    控制GC含量：GC配对（3个氢键）比A-U配对（2个氢键）更稳定，RNA的GC含量建议控制在40%-60%，过高（>65%）易形成致密二级结构，过低（<35%）可能影响RNA整体稳定性（需平衡）；

    引入修饰核苷酸：若需长期保存或减少二级结构，可在转录时掺入修饰核苷酸（如2'-O-甲基核糖核苷酸、假尿苷Ψ），这些修饰可破坏碱基互补配对，降低二级结构稳定性，同时增强RNA抗降解能力（适用于mRNA疫苗、长链RNA合成）；

    添加5'帽子和3'尾（适用于mRNA）：5'端加帽（如m7GpppG）可抑制5'端形成茎环，3'端加poly(A)尾（长度50-200nt）可增加RNA柔性，减少整体二级结构，同时提升RNA稳定性和翻译效率。

 

2.转录反应条件优化：抑制二级结构形成

    提高反应温度：T7聚合酶的最适温度为37-42℃，适当提高温度（如40-42℃）可破坏RNA二级结构的碱基配对（温度升高使氢键断裂），减少转录停滞，尤其适用于GC含量高的RNA；

    优化离子强度：转录缓冲液中通常含Mg²⁺（10-15mM）和K⁺（40-60mM），Mg²⁺过量（>20mM）会促进RNA折叠，K⁺过高（>100mM）会增强碱基配对，需严格遵循聚合酶说明书的缓冲液配方，避免离子浓度异常；

    调整NTP浓度：NTP终浓度通常为1-5mM（各NTP等摩尔浓度），浓度过低会导致转录效率下降，过高可能增加RNA折叠概率，建议按说明书优化（如长链RNA可适当提高NTP浓度至3-5mM）；

    加入变性剂：对于二级结构极强的RNA（如GC含量>70%），可在转录体系中添加低浓度变性剂（如5%-10%DMSO、0.5-1M尿素），破坏碱基配对，但需注意：变性剂可能抑制聚合酶活性，需先做预实验确定最佳浓度（如DMSO浓度超过15%会显著降低T7聚合酶活性）。

 

3.转录后处理：解除已形成的二级结构

    热变性-快速冷却：纯化后的RNA可进行热变性处理——65-70℃保温5-10分钟（破坏二级结构），随后立即置于冰上快速冷却（防止碱基重新配对），该方法适用于短期使用的RNA（如qPCR标准品、体外翻译模板）；

    避免反复冻融：RNA冻融过程中，温度变化会导致二级结构重排，甚至断裂，建议将RNA分装成小体积（如10-20μL），-80℃冻存，使用时快速解冻（37℃水浴1-2分钟），避免反复冻融；

    选择合适的储存缓冲液：储存时可加入少量RNase抑制剂（如0.1U/μL），缓冲液pH控制在7.0-8.0（避免酸性条件下RNA水解），长期储存可加入50%甘油（-20℃冻存，减少冻融损伤）。

 

四、策略3：质量控制与问题排查，确保RNA完整性

1.关键检测指标

    琼脂糖凝胶电泳：1%-1.5%非变性琼脂糖凝胶（含EB或SYBRGreen）电泳，观察RNA条带——完整的RNA应呈现单一、清晰的条带，无弥散带（降解）、无低分子量条带（截短产物）；若条带弥散，可能是RNase降解或二级结构导致（可通过变性凝胶电泳验证：变性凝胶含甲醛或尿素，可解除二级结构，若变性后条带单一，说明是二级结构问题）；

    核酸定量与纯度：Nanodrop检测A260/A280比值（RNA纯品应为1.8-2.1，低于1.8可能含蛋白污染，高于2.2可能含RNA降解产物），A260/A230比值应>2.0（低于2.0可能含盐、酚等杂质）；

    功能验证：根据应用场景验证（如体外翻译需检测蛋白表达量，转染需检测细胞摄取效率，qPCR标准品需检测扩增曲线线性关系）。

 

2.常见问题排查

    条带弥散/降解：

    ①检查耗材、试剂是否RNase污染（可做阴性对照：RNase-free水+RNase抑制剂，孵育后电泳，无条带说明无污染）；

    ②转录后未及时纯化，RNase未被抑制；

    ③储存条件不当（反复冻融、-20℃长期储存）；

    出现截短产物：

    ①模板DNA含终止子或二级结构（测序验证模板序列，优化序列设计）；

    ②转录温度过低，二级结构导致聚合酶停滞（提高反应温度或添加变性剂）；

    ③NTP浓度不足（增加NTP终浓度）；

    二级结构严重（变性凝胶与非变性凝胶条带位置差异大）：①优化序列设计，降低GC含量；②转录时掺入修饰核苷酸；③转录后热变性-快速冷却处理。

 

五、体外RNA合成完整性保障流程

    预处理：RNase-free环境/耗材/试剂准备，模板DNA测序验证（无终止子、无过量互补序列）；

    转录体系：加入RNase抑制剂，优化NTP浓度、离子强度，必要时添加低浓度变性剂；

    反应条件：40-42℃（高GCRNA），合适反应时间（通常2-4小时，长链RNA可延长至6小时）；

    转录后：快速纯化（去除模板DNA、NTP、RNase），热变性-快速冷却（解除二级结构），分装-80℃冻存；

    质量控制：非变性/变性凝胶电泳+Nanodrop检测，功能验证。

    通过以上“全流程防RNase+序列-反应-后处理调控二级结构”的策略，可最大限度保证体外合成RNA的一级结构完整和二级结构可控，满足后续实验需求。