单细胞dna测序技术中，如何减少扩增偏倚，保证基因表达的真实性？

    单细胞DNA测序（scDNA-seq）中，扩增偏倚的核心成因是单个细胞仅含约6pg二倍体基因组DNA，需通过全基因组扩增（WGA）放大至微克级测序用量，而扩增酶的序列偏好性、模板完整性差异、反应条件不均等，会导致不同区域DNA扩增效率失衡（如高GC/重复序列扩增不足、低GC/单一序列过度扩增），最终扭曲基因拷贝数、突变频率等真实遗传信息。要减少偏倚、保证数据真实性，需从“样本制备、扩增技术选择、反应条件优化、数据校正”四个核心环节系统性设计，具体策略如下：

一、样本制备：筑牢模板质量基础，减少初始偏倚来源

    模板DNA的完整性和纯度是降低扩增偏倚的前提，需通过温和处理避免DNA损伤，排除污染干扰：

    温和分离单细胞：优先选择荧光激活细胞分选（FACS）或微流控芯片分选技术，避免机械研磨、反复吹打等剧烈操作——这类操作会导致基因组DNA断裂，断裂片段更易被扩增酶偏好性识别，进而加剧偏倚；分选缓冲液需添加EDTA（螯合Mg²⁺，抑制细胞内DNase活性），pH稳定在7.2-7.6，分选后快速转移至裂解液，避免细胞体外停留过久导致DNA降解。

    低损伤裂解细胞：使用无DNase、无RNase污染的裂解液（含蛋白酶K和温和去污剂如SDS），采用“低温短时”裂解方案（50-55℃孵育10-15分钟），避免高温（>65℃）或长时间孵育（>30分钟）造成DNA变性、断裂；裂解后需通过95℃加热5分钟彻底灭活蛋白酶K，防止残留酶影响后续扩增酶活性。

    修复模板DNA损伤（针对敏感样本）：对于冷冻保存、临床来源的细胞（易出现单链断裂、缺口等损伤），可在扩增前加入DNA修复酶混合物（如T4DNA聚合酶、DNA连接酶），修复模板损伤——损伤的DNA片段会因结构异常被扩增酶优先结合，导致局部过度扩增，修复后可显著提升模板均一性。

    严格排除污染：单细胞样本极易受外源DNA（如环境微生物、操作过程中交叉污染）影响，需在无菌超净台操作，使用RNase-free/DNase-free专用耗材，分选时设置空白对照（仅加缓冲液，无细胞），后续通过测序数据剔除污染序列。

二、核心环节：选择低偏倚扩增技术，从原理上降低偏好性

    不同WGA技术的扩增机制决定了偏倚程度，需优先选择基于“全基因组均衡覆盖”设计的技术，避免单一引物/酶的偏好性局限：

    多重置换扩增（MDA）：这是目前偏倚最低的主流技术之一，核心依赖phi29聚合酶——该酶具有高保真、强链置换活性，搭配随机六聚体引物，可在30℃恒温条件下连续合成10-20kb长片段，能有效覆盖高GC（40%-70%）、重复序列等难扩增区域，全基因组覆盖度可达90%以上，尤其适合拷贝数变异（CNV）和点突变检测，能最大程度保留基因组原始信息。

    组合标签扩增（如LIANTI）：针对高通量场景设计，单细胞裂解后，先用带独特条形码的引物对DNA片段进行标记，再进行少量PCR扩增——通过条形码区分不同细胞的DNA，无需大量扩增即可实现高通量检测，减少PCR循环数（通常≤20个循环），从而降低循环过程中累积的偏倚，适合大规模单细胞CNV分析和肿瘤异质性研究。

    微流控介导的单分子扩增（如10x Genomics Chromium）：利用微流控芯片将单个细胞与“油滴+引物微珠”包裹形成独立反应体系，每个微珠携带独特细胞标签和分子标签，扩增过程在油滴内封闭进行，既避免了不同细胞间的交叉污染，又能通过分子标签追踪单个DNA分子的扩增历程，后续可通过标签计数校正扩增偏倚，同时支持高通量检测（一次可处理数千个细胞），兼顾效率与准确性。

    避免使用高偏倚技术：传统基于PCR的扩增技术（如DOP-PCR）虽操作简单、成本低，但依赖Taq聚合酶的热循环扩增，Taq酶对高GC序列结合能力弱，且热循环过程中易产生错配和扩增不均，偏倚程度较高，仅适合低通量初步筛选，不建议用于高精度遗传信息分析。

 

三、反应条件优化：精细调控扩增过程，减少效率失衡

    即使选择低偏倚技术，反应条件的细微差异也会加剧偏倚，需针对性优化以提升扩增均一性：

    优化扩增酶与引物：优先使用高保真、低偏好性的扩增酶（如MDA中的phi29聚合酶、PCR类扩增中的高保真聚合酶），这类酶对不同序列的结合亲和力更均一，可减少对特定序列的偏好；引物选择随机引物（如随机六聚体、九聚体），避免使用特异性引物（易导致靶向区域过度扩增），引物浓度需严格遵循说明书，过高会引发引物二聚体，过低则导致扩增效率不足。

    调控反应体系成分：模板DNA浓度需控制在扩增酶的最适范围（避免模板过量导致局部竞争抑制，或模板过少加剧随机偏倚）；dNTPs采用等摩尔浓度配比（通常各1-2mM），保证四种核苷酸充足且均衡，避免某类核苷酸短缺导致扩增停滞；缓冲液中Mg²⁺浓度需匹配扩增酶需求（如phi29聚合酶最适Mg²⁺浓度为3-5mM），过高或过低会影响酶活性和序列结合特异性；可添加少量甜菜碱（0.5-1M）或二甲基亚砜（DMSO，5%-10%），这类试剂能降低DNA解链温度，提升扩增酶对高GC序列的扩增效率，减少GC含量差异导致的偏倚。

    优化扩增程序：MDA技术需严格控制恒温时间（通常12-16小时），避免时间过短导致扩增不完全，或时间过长引发过度扩增；PCR类扩增需减少循环数（尽量控制在20-25个循环），循环数越多，扩增偏倚累积越显著，可通过“低循环数+高扩增效率”平衡（如使用高活性扩增酶）；热循环过程中，退火温度需根据引物Tm值优化，避免退火温度过低导致非特异性结合，过高则降低引物结合效率，均会加剧偏倚。

    采用微滴化/分区扩增：将扩增反应分散到大量微小反应单元（如油包水微滴、微孔阵列），每个单元仅含少量模板DNA（甚至单分子），减少不同区域DNA在同一反应体系中的竞争抑制——传统bulk扩增中，高扩增效率的序列会抢占更多酶和dNTPs，抑制低效率序列扩增，而分区扩增可让每个单元内的扩增资源均匀分配，显著降低竞争导致的偏倚。

 

四、数据校正与质量控制：剔除偏倚信号，验证数据真实性

    扩增后的数据仍可能残留部分偏倚，需通过生物信息学校正和多维度质控，筛选真实可靠的信息：

1、生物信息学校正策略：

    分子标签计数校正：利用扩增过程中引入的分子标签（如UMI），追踪每个原始DNA分子的扩增产物——同一原始分子的所有扩增子携带相同标签，通过计数标签数量而非扩增子数量，剔除过度扩增带来的信号冗余，还原原始分子的真实丰度；
序列偏好性校正：基于已知参考基因组，构建扩增酶的序列偏好性模型（如phi29聚合酶对特定k-mer序列的扩增效率差异），通过算法修正不同区域的扩增信号，补偿高GC/重复序列的扩增不足；

    背景噪音过滤：设置阴性对照（无细胞的空白扩增体系），识别环境污染、引物二聚体等背景信号，在数据分析中剔除这类非样本来源的序列；同时过滤低覆盖度区域（覆盖深度低于平均水平1/3的区域），避免因扩增不足导致的假阴性结果。

2、多维度质量控制：

    覆盖度评估：通过测序数据计算全基因组覆盖度（理想状态下>90%），以及覆盖均匀度（各染色体、各基因区域的覆盖深度变异系数<0.3），覆盖度过低或均匀度差，提示扩增偏倚严重；

    拷贝数变异（CNV）一致性验证：对比同一细胞群体中多个单细胞的CNV图谱，剔除偏离群体共识的异常样本（可能因扩增偏倚或细胞异常导致）；

    突变验证：对关键突变位点（如肿瘤驱动突变），采用Sanger测序或数字PCR技术进行验证，排除扩增导致的假阳性突变；

    测序深度优化：针对不同研究目标调整测序深度，如CNV检测需≥30×测序深度，点突变检测需≥100×测序深度，足够的深度可降低随机扩增偏倚对数据解读的影响。

 

总结：减少扩增偏倚的核心逻辑与流程

    核心逻辑是“从源头降低偏倚（样本制备+低偏倚技术）→过程控制偏倚（反应条件优化）→后期校正偏倚（数据处理）”，具体流程可概括为：

    预处理：通过温和分选、低损伤裂解、模板修复，获得完整均一的单细胞基因组DNA；

    扩增：选择MDA、组合标签扩增或微流控介导扩增等低偏倚技术，搭配优化的反应体系（高保真酶、随机引物、适量添加剂）和程序（分区扩增、少循环数）；

    测序与校正：通过分子标签计数、序列偏好性模型等算法校正扩增信号，过滤背景噪音；

    质控：通过覆盖度、均匀度、功能验证（如突变验证、CNV一致性）筛选可靠数据。

    通过这一系统性策略，可最大程度减少扩增偏倚，让单细胞DNA测序数据真实反映细胞的原始遗传信息，为拷贝数变异分析、肿瘤异质性研究、胚胎植入前遗传学诊断等应用提供可靠支撑。