表面等离子共振技术实验步骤

    SPR技术核心用于检测分子间相互作用，以下为通用标准化实验步骤，以最常用的氨基偶联法固定配体为核心，适配主流SPR仪操作，全程遵循超净、无气泡、试剂恒温的操作原则，适配蛋白-抗体、蛋白-小分子、核酸-蛋白等常见相互作用检测，步骤简洁且覆盖实验全流程。

 

一、实验前准备

    仪器调试：开机预热SPR仪，完成自检（光源、检测器、温控、进样系统），设定实验温度（常规25℃，生化实验可选37℃），打开配套软件，建立实验项目，设置进样流速、体积、检测通道（设参比通道消除非特异性结合）。

    试剂处理：配制并过滤脱气实验缓冲液（如HBS-EP、PBS，0.22μm滤膜过滤+超声脱气）；稀释配体（待固定分子）、分析物（流动相分子）至适宜浓度，蛋白类样品避免反复冻融；所有试剂平衡至实验设定温度。

    芯片准备：选择适配传感芯片（如CM5羧基化芯片），检查无划痕、污染，正确装入仪器芯片卡槽，确保密封无漏液。

 

二、芯片活化

    以10μL/min流速向检测通道注入新鲜混合的EDC/NHS活化液（200mMEDC+50mMNHS，1:1体积比），进样体积50-100μL，活化5-10min，激活芯片表面羧基为活性酯基团，活化后直接进入下一步，避免活性基团失活。

三、配体固定

    以10μL/min流速向检测通道注入稀释后的配体溶液，参比通道仅注缓冲液，直至软件显示共振单位（RU）达到预期固定值（小分子数百RU，蛋白1000-5000RU），停止进样。

    立即向检测通道注入1M乙醇胺（pH8.5），进样50-100μL，封闭芯片表面未结合的剩余活性基团，封闭5min后，用实验缓冲液持续冲洗通道，直至检测通道与参比通道的SPR信号稳定，波动≤±1RU。

 

四、基线校准

    保持设定流速（可调至30μL/min），向双通道持续注入实验缓冲液10-20min，观察基线无漂移、无杂峰，确认基线平稳后，记录初始RU值，作为后续检测的基准。

 

五、分析物结合与解离检测

    将分析物设3-5个梯度浓度（含空白缓冲液对照），按从低到高浓度顺序，以30μL/min流速依次向双通道进样，进样体积100-200μL，记录结合阶段SPR信号，观察RU值随时间上升趋势，反映分子结合过程。

    分析物进样完成后，继续注入实验缓冲液，进入解离阶段，解离10-30min（强相互作用可适当延长），记录解离阶段SPR信号，观察RU值随时间下降趋势，反映复合物解离过程。

    每个浓度检测完成后，用缓冲液冲洗通道至信号恢复基线，再进行下一个浓度检测，避免样品残留干扰。

 

六、芯片再生（如需重复使用芯片）

    根据分子相互作用强弱，选择适配再生液（如低pH缓冲液、高盐缓冲液，需预实验验证），以30μL/min流速向检测通道进样50-100μL，再生2-5min，解离芯片表面结合的分析物。

    再生后用缓冲液冲洗通道5-10min，若信号未恢复至配体固定后的基线水平，可重复再生1-2次，仍未恢复则更换芯片。

 

七、实验后处理

    样品检测完毕后，以30μL/min流速用实验缓冲液冲洗芯片和进样管路15-20min，彻底清除残留试剂。

    若短期保存芯片，取出后置于无菌芯片盒中4℃冷藏；若长期停机，按仪器要求用超纯水冲洗管路后吹干。

    关闭仪器模块（光源、检测器），待温度降至室温后切断总电源，保存所有实验原始数据，后续进行数据校正（扣除参比通道信号）、曲线拟合，计算亲和力常数（KD）、结合常数（Ka）、解离常数（Kd）等参数。

 

    全程避免气泡进入管路/芯片，气泡会导致信号尖峰干扰；所有试剂需新鲜配制（尤其是活化液、再生液）；配体固定量不宜过高，防止空间位阻影响分子结合。