噬菌体展示抗体库：从文库构建到特定抗体筛选的核心

    噬菌体展示抗体库技术是一种将抗体基因片段与噬菌体外壳蛋白融合表达，使抗体片段展示于噬菌体表面，并保留其编码基因于噬菌体颗粒内部的高通量筛选平台。该技术已成为发现和优化治疗性或诊断性抗体的核心工具之一。其核心流程可概括为：文库构建 → 抗原固定 → 生物淘选（panning）→ 阳性克隆鉴定 → 抗体表达与功能验证。

一、文库构建

    文库构建是整个流程的基础，决定了后续筛选的多样性与潜力。根据来源不同，抗体库可分为：

    天然库（Naïve library）：从健康人或动物外周血B细胞中提取总RNA，反转录为cDNA后，通过PCR扩增重链可变区（VH）和轻链可变区（VL），再随机组合构建scFv（单链可变片段）或Fab（抗原结合片段）形式的抗体库。

    免疫库（Immune library）：从经特定抗原免疫后的个体B细胞中构建，富集了针对该抗原的高亲和力抗体序列，适用于已知靶点的高效筛选。

    合成库（Synthetic library）：在保守框架基础上，对互补决定区（CDR）进行人工设计和多样化，实现对抗原结合位点的理性控制，便于后续人源化和工程化。

 

    构建过程中需注意：

    使用高保真DNA聚合酶以减少突变；

    保证VH与VL的随机配对，维持库的多样性（通常需达到10⁸–10¹¹个独立克隆）；

    将抗体片段基因插入噬菌体展示载体（如pIII或pVIII融合系统），常用M13噬菌体作为展示平台。

二、抗原准备与固定

    目标抗原的质量与形式直接影响筛选效率。抗原可以是：

    纯化的重组蛋白；

    细胞膜蛋白（使用完整细胞或膜囊泡）；

    肽段、糖类、小分子半抗原（需偶联至载体蛋白）。

 

    抗原通常被固定在固相载体上，如：

    免疫试管（直接包被）；

    链霉亲和素磁珠（用于生物素标记抗原）；

    ELISA板；

    表达目标抗原的活细胞（用于细胞表面靶点筛选，称为“cell-panning”）。

 

三、生物淘选（Panning）

    这是富集特异性结合噬菌体的关键步骤，一般进行3–5轮：

    封闭：用BSA或脱脂奶封闭非特异性结合位点；

    孵育：将噬菌体库与固定化抗原共孵育，允许特异性结合；

    洗涤：严格洗去未结合或弱结合的噬菌体，洗涤强度逐轮增加以提高选择压力；

    洗脱：用低pH缓冲液（如甘氨酸-HCl, pH 2.2）、高pH或竞争性抗原洗脱特异性结合的噬菌体；

    扩增：将洗脱的噬菌体感染大肠杆菌（如TG1或XL1-Blue），重新包装并扩增，用于下一轮淘选。

随着轮次增加，特异性噬菌体比例显著上升。

 

四、阳性克隆鉴定

    完成淘选后，需从最终扩增的噬菌体中挑取单克隆进行鉴定：

    噬菌体ELISA：将单个克隆培养上清中的噬菌体与抗原包被板反应，用抗M13抗体检测结合信号；

    交叉反应性测试：排除非特异或交叉反应克隆；

    测序分析：对阳性克隆的scFv或Fab插入片段测序，分析VH/VL组成、CDR序列及是否重复出现（提示高亲和力候选）。

 

五、抗体表达与功能验证

    将筛选出的抗体基因亚克隆至真核表达载体（如IgG全抗体表达质粒），在哺乳动物细胞（如HEK293或CHO）中表达可溶性抗体，随后进行：

    亲和力测定（如SPR、BLI）；

    特异性与表位分析；

    功能实验（如中和活性、ADCC、CDC、细胞内化等）；

    稳定性、聚集性等理化性质评估。

 

    噬菌体展示抗体库技术通过将基因型与表型偶联，实现了从庞大抗体多样性中高效捕获高亲和力、高特异性抗体的能力。其核心在于高质量文库的构建、严谨的抗原设计、多轮富集的淘选策略以及系统性的功能验证，为抗体药物研发、诊断试剂开发及基础免疫学研究提供了强大支撑。