分子互作研究的方法

    分子互作研究旨在揭示生物大分子（如蛋白质、核酸、脂质、小分子等）之间在结构、功能或调控层面的相互作用关系，是理解信号转导、基因调控、药物靶点识别及疾病机制的核心。随着技术的发展，目前已形成一系列互补性强、适用场景多样的研究方法，可从体外（in vitro）、细胞内（in cellulo）到体内（in vivo）多个维度解析互作事件。

 

一、基于亲和纯化的互作检测

1. 免疫共沉淀（Co-IP）

    利用特异性抗体捕获目标蛋白（“诱饵”），与其在天然状态下结合的“猎物”蛋白一同被富集，再通过Western blot或质谱鉴定互作伙伴。适用于验证已知或疑似蛋白-蛋白互作，保留生理相关性，但依赖高质量抗体且可能受间接结合干扰。

 

2. 下拉实验（Pull-down assay）

    将重组表达的“诱饵”蛋白（常带标签如GST、His、MBP）固定于固相介质（如谷胱甘肽磁珠、镍柱），与细胞裂解液或体外翻译系统中的“猎物”蛋白孵育，洗脱后检测结合蛋白。操作可控性强，适用于体外直接互作验证，但缺乏细胞环境背景。

二、基于能量转移或 proximity 的检测技术

1. 荧光共振能量转移（FRET）

    当两个荧光标记的分子距离小于10 nm时，供体荧光能量可非辐射转移至受体，导致供体荧光减弱、受体增强。通过显微镜或光谱仪检测FRET效率，可实时、动态观察活细胞中分子间接近与构象变化，空间分辨率高，但对荧光标记位置敏感。

 

2. 生物发光共振能量转移（BRET）

    原理类似FRET，但以萤光素酶（如NanoLuc）为供体，荧光蛋白为受体，无需激发光，背景更低，适用于高通量药物筛选。

 

3. 邻近连接实验（Proximity Ligation Assay, PLA）

    在固定细胞或组织中，若两个目标蛋白距离<40 nm，其对应的特异性抗体可连接DNA探针，经连接、扩增和荧光标记后形成可见信号点。单分子灵敏度，可在原位可视化内源性蛋白互作，适用于临床样本。

 

三、基于报告系统或遗传学的互作验证

1. 酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid, Y2H）

    将“诱饵”蛋白与DNA结合域（BD）融合，“猎物”与转录激活域（AD）融合，若二者互作则重建转录因子，激活报告基因（如HIS3、LacZ）。适合大规模筛选cDNA文库中的互作对，但存在假阳性（如自激活）且限于核内环境。

 

2. 哺乳动物双杂交（Mammalian Two-Hybrid）

    在哺乳动物细胞中进行，更接近生理条件，可用于研究翻译后修饰（如磷酸化）对互作的影响。

 

3. 蛋白片段互补 assay（PCA）

    将报告蛋白（如荧光素酶、GFP）拆分为两个无活性片段，分别融合至两个目标蛋白。若目标蛋白互作，报告蛋白片段靠近并恢复功能，产生可检测信号。适用于活细胞动态监测。

 

四、基于表面物理传感的定量分析

1. 表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）

    将一个分子固定于传感器芯片表面，另一分子流过，通过检测折射率变化实时记录结合/解离过程，无需标记，可精确测定亲和力（KD）、结合速率（kon/koff）。广泛用于药物-靶点动力学研究。

 

2. 生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）

    原理类似SPR，但使用光纤生物传感器探针，操作更简便，样品消耗少，适合快速初筛。

 

五、基于交联与质谱的全局互作组学

1. 交联质谱（Cross-linking Mass Spectrometry, XL-MS）

    使用化学交联剂（如DSSO）将空间邻近的氨基酸残基共价连接，经酶解和质谱分析，可获得互作界面的氨基酸级分辨率信息，适用于复合物结构解析。

 

2. 亲和纯化-质谱（AP-MS）

    结合Co-IP与高通量质谱，系统性鉴定与目标蛋白共纯化的全部互作伙伴，构建“互作组”网络，常用于发现新调控因子。

 

六、其他重要方法

1. 凝胶迁移阻滞实验（EMSA）

    用于检测蛋白与DNA/RNA的结合。蛋白-核酸复合物在电泳中迁移速度慢于游离核酸，形成“阻滞带”，适用于转录因子结合位点验证。

 

2. 等温滴定量热法（ITC）

    直接测量分子结合过程中释放或吸收的热量，无需标记，可同时获得KD、ΔH、ΔS、化学计量比等完整热力学参数。

 

3. 微尺度热泳动（Microscale Thermophoresis, MST）

    基于分子在温度梯度场中运动行为的变化检测结合，样品用量极低（μL级），适用于难溶或稀有样本。

 

方法选择原则

    验证已知互作：Co-IP、Pull-down、FRET、SPR；

    筛选未知互作：Y2H、AP-MS；

    定量动力学：SPR、BLI、ITC、MST；

    活细胞动态：FRET、BRET、PCA；

    原位可视化：PLA、免疫荧光共定位（需谨慎解读）；

    结构细节：XL-MS、冷冻电镜（虽非互作专属，但可辅助验证）。

 

    分子互作研究需根据研究目的（验证 vs 发现）、分子类型（蛋白-蛋白、蛋白-核酸等）、所需信息（定性、定量、定位、动力学）以及实验条件（设备、样本、通量）综合选择方法。通常采用多种技术交叉验证，以提高结果的可靠性与生物学意义。