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【上期看点】金开瑞CEO支付宝余额不足不足不足不足......
文章来源:genecreate 作者:genecreate 发布时间:2020-07-31 09:34
7月28日晚8点金开瑞PCR直播首秀你看了吗?
给你印象最深刻的
是振奋人心的支付宝口令红包?
是有才有颜的主播小哥哥小姐姐?
还是一瞬间拉回实验室的双面板移液枪?
亦或是戳破屏幕却失之交臂的代金券?
还是和小编一样脑海中回荡着
金开瑞CEO支付宝余额不足不足不足不足......
PCR
(错过直播的宝宝们可以去看本场视频的回放)
好了,言归正传
 
        我们金开瑞的直播是要将理论和实操相结合,让各位老师/同学清晰地知道实验是怎么做的,从最基础的分子生物学实验到高通量筛选的组学实验,从基因合成到蛋白表达再到抗体制备,从细胞实验(体外实验))再到动物实验(体内实验),我们会通过线上线下同步直播实操的方式让大家一 一了解实验流程,让大家不再只停留在理论部分,以后每周二晚上八点,我们都在直播间不见不散!
       下周二晚8点我们的直播主题也已经定下来了,各位可以先扫码预约直播,以免错过精彩瞬间。
        那在直播开始之前,咱先聊点理论~
        Oligo DNA的人工化学合成始于50年代初期,1980年,全自动的固相DNA合成仪面市后,使得快速、高效合成Oligo DNA成为可能,这大大地推动了生物工程技术的蓬勃发展。现在一般都采用β-乙腈亚磷酰胺化学合成Oligo DNA,将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的合成时从3' →5' 方向进行,通常3' 端的第一个碱基结合在Glass担体 (Controlled Pore Glass,CPG)上。其具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
 
1、合成步骤
  • Step1:脱掉附加在CPG担体上的第一个碱基5' -OH基团上的保护基 (DMTr),准备附加下一个新的碱基;
  • Step2:活化新的碱基单体 (Phosphoramidite),准备与第一个碱基进行反应;
  • Step3:第二个碱基与第一个碱基发生偶联反应;
  • Step4:将没有反应的第一个碱基的5' -OH加帽封死 (Capping),使其不再进一步参与反应;
  • Step5:将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯 (即将三价磷氧化成五价磷)。
  • Step6:重复进行Step1~Step5的循环,直至合成完所需的Oligo DNA序列;
  • Step7:合成结束后,将Oligo DNA分子从CPG上切下,再进行进一步的纯化。
引物合成
 
2、OD数的确定
        一般PCR扩增,2 OD引物,可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接,1 OD就足够了。但是有些研究人员,就做几次PCR,但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长,但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低,出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求,也是一种浪费。
 
3、引物纯度检测
        实验室方便的做法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物,用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和,上样前加热变性(95℃,2mins)。加入尿素的目的一是变性,二是增加样品比重,容易加样。600V电压进行电泳,一定时间后(约2-3小时),剥胶,用荧光TLC板在紫外灯下检测带型,在主带之下没有杂带,说明纯度是好的。如果条件许可,也可以用EB 染色或银染方式染色。
 
4、引物级别选择
引物合成
 
5、引物纯化方式
一般纯化方式
       目前,采用的主打的引物纯化方式是脱盐纯化。其只能纯化掉引物中的盐分,并不能去除含的小片段,价格较为便宜,能满足一般常规的应用。
1)C18柱
        又称为简易反相柱,对DNA有特异性吸附,可被有机溶液洗脱,但不会被水洗脱。因此能有效地去除盐分,但不能有效去除比目的片段短的小片段。该方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
2)OPC纯化
        采用寡核苷酸纯化柱 (Oligonucleotide Purification Cartridge,OPC)纯化,制品纯度保证80 ~ 90%。此级别制品可用作PCR引物、DNA测序引物、各种探针等。该级别只提供长度在35 mer以下的合成DNA制品。序列更长时,制品的纯度得不到保证。
3)HAP纯化方法
        HAP(High Affinity Purification)其原理是利用合成引物5'-端DMT基团对HAP树脂专一性吸附,而不含DMT的短链DNA不被吸附,从而达到分离纯化的目的。制品纯度可达到80~90%,可以满足杂交探针、测序、常规PCR(不再做进一步克隆实验)等用途了。但是因为其专一性吸附 DMT 能力有限,不免仍然有短片段带入的可能,而且负载量小。特别是对长于39 碱基以上的片段纯化效果不好。此级别只提供长度在10-39mer以下的合成oligo DNA制品。序列更长时,制品的纯度得不到保证。
4)RPC纯化
        RPC纯化是通过反相净化滤芯 (Reverse Phase Cartridge) 对引物进行纯化,纯化原理与反相HPLC纯化一样。与反相HPLC比较,RPC是一种有效且更加经济的纯化方式。反相净化滤芯通常包含一种疏水基质如 C18的硅胶,能够很好的吸附DNA,并且可以用水轻松地将切割下来的保护基团和短的引物片段从反相柱上洗掉。RPC纯化的引物可以应用于DNA测序、 PCR及基因合成等。
5) TON纯化
基于特异和反相层析法,从合成好的产物中去除失败序列,提供最终的目标序列。适于35个碱基以下的引物。毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)纯度大于75%。
 
PAGE纯化方式
       PAGE纯化价格适中,纯度较高,能满足大多数应用,尤其是长度大于50个碱基的长链引物。
1)经典PAGE纯化
        PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis),该方法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,对DNA片段进行分离,然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化基于尺寸和构象分离全长产物和失败序列,可以分离相差一个碱基的引物(120碱基以内),从而提供高纯度的引物。纯化后的DNA纯度大于90%,相比与其他纯化方法,PAGE纯化对长链Oligo DNA (大于50 mer)的纯化特别有效,制品纯度保证90 ~ 95%。如订购的DNA欲用作RT-PCR引物、各种探针,或用于PCR克隆测序、定点突变等,请选用PAGE纯化制品。
2)ULTRA PAGE纯化
        理论上分析型PAGE变性电泳,可以区分引物之间一个碱基的差别。经过PAGE纯化的引物,特别是长引物要的量都比较高,上样量都是非常大,电泳时的条带往往比较宽,带与带之间有重叠,分辨率有所下降,电泳后割带回收目的引物时,导致割的条带有时可能比较宽,很难避免割到差别仅一个或几个碱基的引物。因此,将原有的PAGE纯化方式升级优化为现在的ULTRA PAGE纯化方式,即在PAGE纯化的同时配合质谱对DNA进行定性分析,以保证回收片段的正确性。
 
HPLC纯化方式
       价格最高,纯度也最好,适用于小于40个碱基的未修饰寡核苷酸,用于定点突变、克隆、蛋白结合凝胶迁移电泳分析、治疗用途。HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理,对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高,批量生产效率不高。
       好了,理论部分就介绍到这里了,更多精彩请锁定我们的直播!
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