冻干RNA与溶解RNA的最佳存储条件分别是什么？反复冻融会对RNA造成哪些损伤？

一、 冻干 RNA 的最佳存储条件

    冻干 RNA 因去除了水分，核酸分子的构象相对稳定，降解速率大幅降低，核心存储原则是低温、干燥、避光、防污染。

    短期存储（数周内）：可置于 -20℃ 冰箱，需密封在离心管中，同时在管外包裹封口膜防止水汽进入，并放入含干燥剂（如硅胶干燥剂）的离心管盒内，避免冻干 RNA 吸潮。

    长期存储（数月至数年）：优先选择 -80℃ 超低温冰箱，条件允许时可分装为单次使用的小份，减少反复取出导致的温度波动和吸潮风险；若需更长期的保存（如数年以上），可考虑液氮（-196℃）存储，但需注意使用耐低温的冻存管，防止管体破裂。

    关键注意事项：冻干 RNA 极易吸潮，吸潮后会迅速降解，因此取样时需在超净工作台内快速操作，避免在潮湿环境中暴露过久；严禁反复开盖和室温放置。

二、 溶解 RNA 的最佳存储条件

    溶解 RNA 的稳定性远低于冻干 RNA，核心存储原则是低温、抑制 RNase 活性、避免反复冻融。

    短期存储（1–2 周）：溶于经 DEPC 处理的无 RNase 水或 RNase-free 的 TE 缓冲液（pH 7.5–8.0）中，置于 -20℃ 冰箱，需分装为小体积（如 10–20 μL / 管），减少单次使用时的反复冻融。

 

    长期存储（数月至数年）：

    首选 -80℃ 超低温冰箱，同样需小份分装，且建议在 RNA 溶液中加入终浓度 0.1–0.5 U/μL 的 RNase 抑制剂（如 RNasin），进一步抑制残留 RNase 的活性；

    若条件允许，可在 RNA 溶液中加入等体积的甘油（终浓度 50%），置于 -20℃ 可避免冻融（甘油可降低溶液冰点），但需注意甘油可能对后续部分实验（如体外翻译）有影响。

    关键注意事项：溶解 RNA 的所有耗材（离心管、枪头）必须为 RNase-free；避免将 RNA 溶液置于 4℃或室温超过 1 小时，否则会加速 RNA 降解。

 

三、 反复冻融对 RNA 造成的损伤

    RNA 分子本身稳定性较差，反复冻融（冻存 - 解冻循环）会从物理和化学层面对其造成不可逆损伤，主要表现为以下几点：

 

1、物理断裂，导致片段化

    冷冻过程中溶液会形成冰晶，冰晶的生长会对 RNA 分子产生机械剪切力；反复冻融会让冰晶多次形成和融化，持续的剪切作用会使完整的 RNA 长链断裂为小片段。表现为琼脂糖凝胶电泳时，RNA 条带弥散、无清晰条带，或 28S/18S rRNA 的条带亮度比失衡（正常比值约 2:1，损伤后比值降低）。

 

2、RNase 激活，加速酶解降解

    即使是 RNase-free 的环境，也可能存在微量的残留 RNase。冻融过程的温度波动会激活这些残留的 RNase 活性，同时反复解冻会让 RNA 分子与 RNase 的接触更充分，导致 RNA 被酶解为更小的片段，最终完全降解为核苷酸。

 

3、二级结构破坏，丧失生物学活性

    RNA 具有复杂的二级结构（如茎环结构），这些结构与其功能（如翻译、逆转录）密切相关。反复冻融的温度变化会破坏 RNA 的氢键，导致二级结构解离或异常折叠，即使 RNA 链未断裂，也会丧失其原有的生物学活性，影响后续实验（如 RT-PCR、Northern Blot、体外翻译等）的结果。