酵母单杂交技术的实战应用：从诱饵设计到假阳性排除的实操指南

一、 诱饵序列设计与载体构建策略

    做酵母单杂交（Y1H），第一个绕不过去的坎就是诱饵序列的设计。很多人觉得不就是把一段启动子区域克隆到报告基因上游嘛，有什么难的？但实际上，诱饵序列的长度、重复数、载体选择，每一步都会直接影响你最后筛到的结果质量和数量。

    先说长度。诱饵DNA片段多长合适？这个问题没有标准答案，但有个经验范围：通常取目标启动子上游300至800bp的区段。太短了，比如少于100bp，可能只覆盖到一两个转录因子结合位点，筛到的互作蛋白数量有限，而且容易漏掉远距离调控元件结合的因子。太长了也不行，超过1kb的片段里可能包含多个隐蔽的启动子样序列，后面自激活的问题会把你折磨死。我自己的经验是，先用生物信息学工具预测一下候选结合位点集中在哪个区域，然后以这个区域为中心，前后各延伸150到200bp，这样既能保证覆盖度，又不会引入太多噪音。

    串联重复序列的构建是另一个关键决策。把诱饵序列做成1x、3x还是5x串联重复？这里面的逻辑是：多拷贝可以增加转录因子结合的概率，提高报告基因的表达水平，从而让信号更容易被检测到。但拷贝数越多，风险也越大。5x重复确实能放大信号，但同时也放大了背景，如果诱饵序列里有一点点微弱的启动子活性，5x之后就会被放大到不可收拾。3x是大多数实验室的折中选择，信号够强，背景还算可控。如果你对自己的诱饵序列很有信心，做了充分的自激活预检测，1x也可以，而且1x的结果更接近生理真实状态。我的建议是：先做3x试水，如果信号太弱再考虑加到5x，如果自激活严重就降到1x。

    载体系统的选择直接决定了后续实验的走向。pLacZi和pHIS2是两个最常用的系统。pLacZi用的是lacZ报告基因，显色反应直观，X-gal显蓝就能判断，但定量能力有限，而且整合到酵母基因组后拷贝数不确定。pHIS2用的是HIS3报告基因，可以通过3-AT浓度梯度来精确调节筛选压力，更适合做文库筛选这种需要调门槛的实验。诱饵载体构建策略的核心就在于：你要根据后续筛选的需求来倒推选哪个系统。如果只是验证一两个已知蛋白的结合，pLacZi的显色系统够用；如果要做大规模文库筛选，pHIS2加上3-AT梯度调节是更可靠的选择。还有更新的pBait-AbAi系统，用AbA抗生素做反向筛选，背景更低，但操作门槛也高一些。

    最小启动子序列的保留问题经常被忽略。很多载体自带一个最小TATA区，你需要决定要不要在诱饵序列里保留自己的TATA box。一般来说，诱饵序列应该尽量避开包含TATA box和转录起始位点附近的区域，因为这些区域本身就可能驱动基础转录，造成自激活。保留50到100bp的最小启动子序列是必要的，保证报告基因有基础表达框架，但多了一定添乱。

    最后说一个容易被忽视的点：诱饵序列的GC含量和二级结构。GC含量高于60%的片段容易形成稳定的发夹结构，影响转化效率和后续的PCR验证。如果发现某段诱饵GC含量异常高，可以考虑稍微调整截取的起止位置，避开明显的GC富集区。

二、 cDNA文库质量评估与转化效率优化

    cDNA文库构建与转化是Y1H实验的第二个核心环节，文库质量直接决定你能筛到什么、筛到多少。说句实在话，很多人Y1H筛不出来东西，不是诱饵的问题，是文库质量太差。

    文库复杂度的评估有几个硬指标。首先是原始克隆数，一个好的酵母单杂交文库，原始克隆数至少要达到1乘以10的6次方以上，最好能到5乘以10的6次方。低于这个数量级，文库的代表性就不够，很多低丰度转录本的cDNA根本没被收录进去。其次是重组率，也就是实际插入片段的克隆占总克隆的比例。用蓝白斑筛选或者菌落PCR随机挑96个克隆来算，重组率低于80%的文库基本不能用，因为空载体克隆太多会稀释筛选信号。第三是插入片段的长度分布，随机挑几十个克隆做菌落PCR，片段长度应该集中在0.5到3kb之间，平均1.5kb左右。如果大部分片段都小于500bp，说明cDNA合成或建库过程中发生了严重降解。

    mRNA质量是文库质量的上限。建库之前一定要跑个Bioanalyzer看RIN值。RIN也就是RNA Integrity Number，是Agilent公司提出的RNA完整性指标，范围1到10，10代表完全未降解。做Y1H文库用的总RNA，RIN值至少要8以上，最好9以上。RIN低于7的RNA样品，建出来的文库插入片段会普遍偏短，因为mRNA降解后反转录出来的cDNA是碎片化的，这些碎片化的cDNA虽然能建库，但筛出来的蛋白很多是截短的形式，没有完整的DNA结合结构域，后续验证时功能不完整。

    酵母转化效率的瓶颈在哪里？两种方法各有特点。醋酸锂（LiAc）转化法操作简单，不需要电转仪，但效率一般在10的3次方到10的4次方转化子每微克DNA，对于做文库这种需要覆盖百万级克隆的实验来说，效率偏低。电转化法效率可达10的5次方到10的6次方每微克，适合大规模文库转化，但需要制备高浓度的电转感受态，而且对DNA纯度要求高，如果cDNA文库质粒制备时混了盐或者乙醇残留，电转时容易打火，效率断崖式下降。我的经验是：如果实验室有电转仪，做文库筛选一律用电转；没有电转条件，那就多做几批LiAc转化，靠数量来凑够覆盖度。

    共转化还是顺序转化？共转化就是把诱饵载体和cDNA文库质粒同时转入酵母，操作快，但两个质粒同时进入一个酵母细胞的概率低，效率打折。顺序转化是先把诱饵载体整合到酵母基因组里，鉴定好单克隆、确认自激活水平之后，再转化cDNA文库质粒。顺序转化虽然多走一步，但好处是诱饵背景已经摸清楚了，筛选到的信号更可信。做酵母单杂交文库筛选时，强烈推荐顺序转化，宁可多花一周做整合和验证，也不要图快做共转化，后面出了问题分不清是诱饵还是文库的事。

    大规模转化时的操作细节也值得说道。感受态细胞的新鲜度太关键了，制备当天用或者4度过夜保存第二天用，效率最好；冻存感受态可以用，但效率至少打对折。热休克时间也是，42度热休克的标准是40分钟，但这个时间对不同菌株的感受态差异很大。这种细节没法从protocol里看出来，只能自己做梯度预实验。

图1 酵母选择性培养基上的菌落筛选实验

 

三、 筛选条件设置与阳性克隆识别

    3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）是HIS3报告系统的门槛调节器，它的作用是竞争性抑制HIS3基因产物。说白了就是：如果你加了3-AT，酵母必须表达更多的HIS3才能活下来，这样只有真正有互作的阳性克隆才能长起来，那些低水平自激活的背景菌会被卡住。

    3-AT浓度梯度预实验怎么设计？千万别上来就用文献里的浓度，别人的诱饵和你的不一样。正确做法是：先做一组浓度梯度，0、10、25、50、75、100、150、200mM，每管涂100微升诱饵菌株（已经整合了诱饵载体、没有文库质粒）的稀释液到对应的SD缺His加3-AT平板上。30度培养3到5天，观察哪个浓度下菌落完全不生长。这个完全不生长的浓度就是你的筛选浓度。理想情况下，这个浓度在25到100mM之间。如果需要200mM以上才能压住背景，说明自激活太严重了，不是加3-AT能解决的，得回去修改诱饵设计。找到最低抑制浓度后，筛选时用这个浓度或者稍微高一点（比如找到75mM能抑制，筛选就用80到100mM），留一点余量防止文库质粒带入的额外背景。

    AbA（Aureobasidin A）抗生素用在pBait-AbAi系统里。这个系统的报告基因是AUR1-C，AbA能抑制这个基因的产物，原理和3-AT类似，互作阳性克隆表达AUR1-C从而抵抗AbA。AbA的浓度摸索也是梯度法，通常范围在100到2000ng每毫升。AbA的好处是抑制效果更干净，背景和阳性之间的窗口更大，不像3-AT有时候会出现抑制了但说不准是哪档浓度的模糊地带。

    筛选培养基的配制是个技术活。SD缺His的基础培养基本身不难配，但加上3-AT之后有几个坑。第一，3-AT对热敏感，不能高压灭菌，必须先配成高浓度母液（比如1M），过滤除菌后再加到已经灭菌冷却到50度以下的培养基里。第二，氨基酸缺陷型的计算要仔细，缺什么氨基酸就在基本培养基里补什么，唯独不补你要筛选的那个（His缺陷就不加组氨酸）。各种氨基酸的终浓度不一样，Leu 20mg/L、Trp 20mg/L、Ura 20mg/L、His 20mg/L等等，这些要提前算好，别每次临时查。我建议做一张Excel表，把所有缺二缺三缺四的组合列好，每次直接查表称量，减少出错概率。第三，倒板时培养基温度别太高，50到55度之间倒，太热会降解3-AT或AbA。

    培养温度和时间很关键。30度是标准温度，但有时候30度筛出来的背景偏高，可以把温度提到37度，高温会增加报告基因表达的选择压力，背景更容易被3-AT压制，阳性的信号也更明确。代价是37度下酵母生长偏慢，筛选周期可能要拉长到5到7天而不是标准的2到3天。我的做法是：第一轮筛选30度培养3天，快速看到结果；如果有大量背景生长不好区分，再做一轮37度加3-AT浓度微调的精细筛选。

    阳性克隆筛选验证的初步判断标准其实挺靠经验的。首先看菌落大小，真正的阳性克隆通常在3-AT筛选压力下长得又快又大，3天就能看到明显菌落，直径1到2mm。背景克隆通常长得很慢很小，像针尖一样。其次看颜色，有些系统用了颜色标记，阳性克隆可能有颜色差异。第三看生长速度，4天还没长出来的大概率不是强阳性，或者就是假阳性的弱信号。我的原则是：第一轮先粗筛，挑菌落大、长得快的；第二轮再做精细验证时把灰色地带的弱信号也纳入，因为有些真实的弱互作就是这么被筛掉的。

四、 自激活检测与背景消除

    自激活是Y1H实验里最让人头疼的问题，没有之一。你费了半天劲把诱饵序列整合进去，结果没加任何cDNA文库质粒，报告基因自己就开始表达了，这说明诱饵序列本身就能驱动报告基因转录，和你的筛选目的完全无关。这种背景不消除掉，后面筛到的所有阳性都得打问号。

    自激活现象的来源主要有两个。第一个来源是诱饵序列内部含有的隐蔽启动子活性。你截取的那段启动子DNA，除了转录因子结合位点，还可能包含了些类似TATA box的序列、TFIID结合位点、或者一些通用的转录起始元件。这些元件在酵母里也能起作用，直接驱动下游报告基因表达。第二个来源是整合位点的染色质效应。诱饵序列整合到酵母基因组的某个位置后，如果恰好落在一个开放染色质区域或者附近的内源启动子有增强子活性读穿效应，就可能造成报告基因的泄漏表达。

    报告基因泄漏表达的原因和整合方式也有关。如果你的诱饵载体是游离型而不是整合型，拷贝数不稳定可能时高时低，背景波动大。整合型载体（比如pLacZi整合到URA3位点）拷贝数固定，但如果整合位点附近有活跃的转录单元，也可能出现泄漏。

    自激活检测与背景消除的核心策略是先诊断后治疗。诊断阶段，把含有诱饵载体但不含文库质粒的酵母菌株涂到含不同浓度3-AT（或AbA）的缺陷培养基上，找到最低抑制浓度。如果0mM 3-AT就不长，恭喜你，没有自激活，可以直接筛。如果需要50到100mM才能压住，可以接受，但筛选时就要加这个浓度的3-AT。如果200mM都压不住，自激活太严重，必须修改诱饵设计。整个诊断过程其实就是自激活检测与背景消除这个关键环节的实际操作，务必在文库转化之前完成。

    自激活消除的具体策略有几种。第一，缩短诱饵序列。如果完整片段有自激活，可以尝试做一系列截短突变，找到驱动自激活的具体区域，然后把那段去掉保留其他部分。第二，降低拷贝数。如果用的是游离型载体（CEN/ARS低拷贝），换成CEN型比2微高拷贝型背景更低。第三，增加3-AT浓度，但这是治标不治本，浓度太高（大于200mM）会影响酵母存活和正常互作的检出。第四，换报告基因，从HIS3换成AbA抗性基因，或者从LacZ换成MEL1（α-半乳糖苷酶），不同的报告基因对同一诱饵的泄漏程度可能不一样。

    对照设置的重要性怎么强调都不过分。空载体对照，转入不含诱饵序列的空载体，可以排除载体本身骨架序列带来的自激活。已知互作阳性对照，用文献已经报道的转录因子和启动子互作对做对照，可以验证你的整个系统是否正常工作。阴性对照，转入不相关的cDNA或者空文库载体，可以排除文库质粒骨架序列带来的非特异性信号。三组对照缺一不可，少了任何一个都无法对筛选结果做出可靠判断。

五、 阳性克隆的回溯验证流程

    从筛选平板上挑到一堆阳性克隆只是万里长征的第一步，阳性克隆筛选验证的真正功夫在后面。挑菌容易验证难，很多实验室的Y1H数据最后不可靠，不是因为筛的问题，是验证不充分。

    质粒提取与测序是第一步，但酵母质粒提取比大肠杆菌难多了。酵母有细胞壁，普通的碱裂解法提不动。常用的方案是先用zymolyase或者lyticase破壁，再做质粒提取。还有一个简单粗暴的办法：用boiled-SDS方法，挑菌落到50微升的20mM NaOH里煮沸10分钟，然后取1微升做PCR模板，直接用载体通用引物（比如T3/T7或者AD引物）扩增插入片段。这种方法不需要提质粒，快，但只能拿到片段大小信息和测序模板，不能做回转验证。如果要做回转，还是得老老实实提质粒。建议用商品化的酵母质粒提取试剂盒，手提的话得加玻璃珠剧烈振荡破壁，产量和纯度都不太稳定。提取的质粒可以直接送测序，用AD载体上的通用引物就行。

    一对一回转验证为什么不能只做一次？因为文库筛选时是一个cDNA池和诱饵共表达的，筛到的阳性克隆可能是真互作，也可能是多个cDNA同时存在造成的假象，比如cDNA A本身没有DNA结合活性，但它表达的蛋白间接影响了报告基因表达。回转验证就是把提取到的单个cDNA质粒重新转化到只含诱饵载体的新鲜酵母里，一对一地看互作能不能重现。至少做两次独立的回转，第一次确认互作可重现，第二次排除质粒污染或者操作误差。每次回转都设空载体对照和已知互作对照。

    互作特异性验证是更高层次的要求。突变诱饵序列是经典做法：在转录因子结合位点的核心区域引入点突变（通常是4到6个碱基的突变），构建突变诱饵载体。如果野生型诱饵能激活报告基因而突变型不能，说明互作是特异性的，依赖于具体的结合位点序列。

    体外验证方法是Y1H结果可信度的关键补充。EMSA（凝胶阻滞实验）用纯化的转录因子蛋白和标记的诱饵DNA探针，在体外直接看结合不结合，加上冷探针竞争和突变探针对照，能给出最直接的结合证据。ChIP-PCR（染色质免疫沉淀后PCR检测）则在体内条件下验证，用抗体拉下和转录因子结合的DNA片段，PCR检测诱饵序列是否被富集。

    功能验证包括报告基因活性定量和剂量效应曲线。定量方面，可以用ONPG底物测LacZ活性，或者用荧光素酶报告系统做定量读数。剂量效应曲线是指，改变转录因子的表达量（比如用不同强度启动子或者诱导表达系统），看报告基因活性是否随之线性变化。如果存在剂量效应，说明互作是有生理意义的调控关系，而不是非特异性的结合噪音。

图2 凝胶电泳验证转录因子与DNA的结合特异性

 

六、 假阳性排除策略

    酵母单杂交假阳性排除是Y1H实验最考验经验和判断力的环节。筛到的阳性克隆越多越要警惕，筛到5到10个可信的互作是正常水平，筛到50个以上反而要怀疑实验设计是不是出了问题。

    假阳性的来源主要有几类。第一类是非特异性DNA结合蛋白，有些蛋白天然就喜欢结合DNA但不具备调控功能，比如核糖体蛋白、组蛋白、染色质结构蛋白。它们在Y1H里会被筛出来，因为它们确实能结合诱饵DNA，但这种结合没有生物学意义。第二类是支架蛋白，这些蛋白不直接结合DNA，但它们能稳定或者促进其他蛋白和DNA复合物的形成，在Y1H系统里间接激活了报告基因。第三类最隐蔽，代谢酶类。某些代谢酶在酵母里高表达时会有非特异性的DNA结合活性，比如醛缩酶、烯醇化酶这些糖酵解酶，在Y1H文献里反复作为假阳性出现。

    sticky蛋白的识别需要参考已知假阳性蛋白数据库。有个经典文献总结了Y2H和Y1H中常见的假阳性蛋白清单，包括热休克蛋白（Hsp70、Hsp90家族）、核糖体蛋白、细胞骨架蛋白、泛素相关蛋白等等。拿到测序结果后，第一件事就是比对这份清单，如果你的候选蛋白在黑名单上，不是一定就是假阳性，但需要更严格的额外验证。

    阳性克隆频率与可信度的关系是个概率问题。假设你的cDNA文库有100万克隆，筛了100万转化子后得到10个阳性，这个频率大概是合理的，10的负5次方到10的负6次方的假阳概率在生物学互作筛选里属于正常范围。但如果你筛了10万克隆就冒出来100个阳性，10的负3次方的概率太高了，大概率是诱饵序列本身有广泛的非特异结合能力，或者筛选条件太松了（3-AT浓度不够）。这时候不要急着高兴，先收紧筛选条件重新筛。

    多报告基因系统是降低假阳性的有效手段。双重筛选的逻辑是：一个蛋白如果通过非特异性机制激活了一个报告基因，它不一定能同时激活另一个，因为两个报告基因的启动子设计、整合位置、检测方式都不同。常用的双报告系统比如HIS3加LacZ，或者HIS3加MEL1，先在HIS3筛选板上挑阳性，再转到LacZ显色板上看显蓝情况。只有两个报告基因都阳性的克隆才算通过初筛，这种交叉验证能把假阳性率降一个数量级。

    统计学方法评估筛选结果也很重要。做高通量Y1H筛选时（比如筛选几百个转录因子对几千个启动子的互作矩阵），可以用富集分析来判断某个互作是否显著高于随机期望。具体做法是：计算每个转录因子和启动子组合在重复实验中出现的频率，和随机背景频率做卡方检验或者Fisher精确检验，然后做FDR（False Discovery Rate）校正。FDR小于0.05的互作才算通过统计门槛。

七、 转录因子结合位点的精细鉴定

    从Y1H筛到互作蛋白只是知道了谁和这段DNA结合，要进一步做到转录因子结合位点鉴定，还需要一系列精细的定位实验。这个过程中，删除系列突变策略是最核心的手段。

    删除系列突变的思路很直观：把诱饵DNA片段从两端逐步截短，构建一系列长度递减的诱饵载体（比如从800bp做12个截短体，每个差60到70bp），然后分别和筛到的转录因子做Y1H互作检测。哪个截短体互作信号消失了，结合位点就落在被截掉的那段序列里。进一步在定位到的区域内做点突变，把候选结合位点的核心碱基逐个突变，精确定位到具体的6到10bp结合motif。这个过程有点像基因定位的染色体步查的微缩版，工作量不小但思路清晰。每个突变体都要做正反两个方向验证（野生型应该阳性，突变型应该阴性），确保结论可靠。

    DAP-seq（DNA Affinity Purification sequencing）和Y1H是很好的互补验证。DAP-seq的做法是：把纯化的转录因子蛋白固定在磁珠上，用它来钓基因组DNA片段，然后把钓到的DNA测序，通过reads富集峰来定位结合位点。DAP-seq的好处是高通量，一次实验能看到全基因组范围内该转录因子的所有结合位点，而且完全在体外进行，不受细胞内其他蛋白干扰。Y1H筛到的是候选互作，DAP-seq给出的是全基因组结合图谱，两者交叉验证，互相补充。如果Y1H筛到的互作在DAP-seq中也能看到对应的结合峰，可信度就很高了。

    凝胶阻滞实验（EMSA）验证结合的特异性是金标准之一。用纯化的转录因子蛋白和标记了生物素或同位素的DNA探针（探针就是Y1H里定位到的结合位点序列）孵育，跑非变性聚丙烯酰胺凝胶。如果蛋白结合了DNA，复合物在凝胶里跑得慢，会出现一条上移的shift条带。EMSA的对照设计很关键：冷探针竞争、突变探针对照、无关蛋白对照三组同时做好，结果才有说服力。

    ChIP-qPCR在内源条件下的验证是连接体外实验和体内生理的桥梁。用转录因子的特异性抗体对染色质做免疫沉淀，然后用qPCR检测诱饵启动子序列在沉淀DNA中的富集程度。如果靶启动子序列相比阴性对照区域有显著富集（通常2倍以上且统计显著），说明该转录因子在细胞内确实结合了这个启动子。ChIP实验的难点在于抗体的质量和特异性，很多转录因子没有好的ChIP级抗体，这时可以考虑用转基因标签策略（比如35S加TF加FLAG融合蛋白做anti-FLAG ChIP）。

    结合位点的保守性分析是验证的最后一步，也是最有进化生物学意义的一步。用定位到的结合motif在不同物种的同源启动子序列中搜索，如果这个结合位点在多个近缘物种的直系同源基因启动子中保守存在，说明它受到了进化选择压力，功能上重要。有些结合位点在模式物种之间不保守但在科内保守，这取决于你的研究物种和目标基因的进化距离。如果跨物种都保守，基本可以认定这个结合位点是功能性的调控元件，不是随机出现的序列噪音。

图3 蛋白质-DNA互作网络与转录因子结合位点分析

 

八、 与其他互作技术的联用方案

    Y1H不是孤立的技术，它的最大价值在于和其他互作检测技术联用，形成从筛选到验证到功能确证的完整证据链。

    先说Y1H和Y2H（酵母双杂交）的区别。Y1H检测的是蛋白和DNA的互作，转录因子和启动子DNA片段之间的直接结合。Y2H检测的是蛋白和蛋白的互作，两个蛋白之间是否直接结合。两者的适用范围完全不同，不能互相替代。转录因子结合位点鉴定用Y1H最直接，但如果你想知道转录因子和哪个共调控因子形成复合物来调控这个启动子，就得用Y2H。ChIP-seq则在体内条件下告诉你转录因子在全基因组的结合图谱。三者结合：Y1H给出体外候选互作，ChIP-seq确认体内结合，Y2H找到互作伙伴，完整的调控网络就出来了。

    Y1H筛选加双荧光素酶报告系统的验证流程是目前植物转录因子研究的主流方案。流程是：Y1H筛到候选转录因子和启动子互作后，把启动子片段克隆到荧光素酶报告载体（比如pGreenII-0800-LUC）上游，把转录因子ORF克隆到效应载体（比如pCAMBIA1300-35S加TF），然后通过农杆菌侵染或者原生质体转化共表达两个载体，检测LUC和REN双荧光素酶比值。如果比值显著上升，说明转录因子在植物细胞内确实激活了该启动子，这是从酵母系统到植物系统的跨系统验证，可信度比单纯Y1H高得多。

    Y1H和Pull-down加Mass Spec的组合策略适合挖掘转录因子复合物的组分。Y1H筛到的转录因子直接结合启动子，但很多时候转录因子的激活或抑制活性依赖于和其他蛋白形成的复合物。用转录因子做诱饵蛋白做Pull-down（GST-pulldown或者co-IP），然后质谱鉴定互作蛋白，可以得到完整的调控复合物组分。再回过头用Y2H验证这些组分之间的直接互作关系，就能画出整个调控复合物的互作拓扑图。这套组合拳在研究转录因子复合体的时候特别好用，单靠Y1H只能看到冰山一角。

    植物转录因子研究中的全流程方案设计，我的经验是分三步走。第一步，用Y1H做大规模文库筛选，找到候选的启动子结合蛋白。第二步，用ChIP-qPCR和EMSA验证结合的特异性和体内真实性。第三步，用荧光素酶报告系统和转基因突变体验证功能，在植物体内过表达或者敲除该转录因子，看靶基因表达量和表型是否变化。这三步走下来，从体外到体内、从分子到表型，形成闭环证据链。

    高通量Y1H（arrayed Y1H）是近年来的发展趋势。传统的Y1H是文库筛选，把整个cDNA文库一次性转入，看筛到什么是什么。Arrayed Y1H则反过来：把已知的转录因子ORF一个一个地克隆到AD载体里，形成一个有序列的阵列，然后逐一和诱饵测试互作。好处是每个互作都有明确的身份（不用测序就知道是哪个蛋白），可以做矩阵式筛选（N个转录因子乘以M个启动子），适合做调控网络的系统性构建。坏处是工作量大，1000个转录因子乘以100个启动子等于10万个互作测试。目前已经有一些自动化平台在做这件事，用机器人挑菌、点板、读板，一天能测几千个互作。这种系统级的方法正在把Y1H从一次筛一个的工具变成构建调控网络的平台级技术。