dna探针的合成方法有哪些步骤?

    DNA探针是带有标记物（如放射性同位素、荧光基团）的单链DNA片段，能与目标核酸序列特异性杂交，其合成方法主要分为化学合成法和生物合成法两大类，具体步骤如下：

一、化学合成法（固相亚磷酰胺法，主流人工合成手段）

    该方法适用于合成短链DNA探针（通常≤100nt），可精准控制序列，步骤标准化、自动化。

 

1、固相载体活化

选择固相载体（如可控孔径玻璃、聚苯乙烯），将第一个核苷酸的3'-羟基通过连接臂与载体共价结合，确保后续合成在载体上进行，便于分离纯化。

 

2、脱保护

    核苷酸的5'-羟基通常被二甲氧基三苯甲基（DMT）保护，用三氯乙酸（TCA）处理，脱除DMT基团，暴露出5'-羟基，为下一步缩合反应做准备。

 

3、缩合反应

    加入活化的亚磷酰胺单体（带有5'-DMT保护、碱基保护基团），在四唑催化剂作用下，新加入的单体3'-亚磷酰基与载体上核苷酸的5'-羟基发生缩合，形成亚磷酰胺二酯键，延长DNA链。

 

4、盖帽反应

    用乙酸酐和N-甲基咪唑封闭未参与缩合的5'-羟基，防止其在后续反应中延伸，减少错配副产物。

 

5、氧化反应

    用碘的四氢呋喃溶液处理，将不稳定的亚磷酰胺二酯键氧化为稳定的磷酸二酯键，完成一个核苷酸的添加循环。

 

6、循环延伸

重复脱保护-缩合-盖帽-氧化的循环，直到合成出目标长度的DNA序列。

 

7、切割与脱保护

    用浓氨水将合成的DNA链从固相载体上切割下来，同时脱除碱基上的保护基团；再通过加热或碱性条件去除磷酸基团的保护基。

 

8、纯化与标记

    采用高效液相色谱（HPLC）或聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化DNA片段，之后在探针的末端或内部引入标记物（如荧光素、生物素），得到可使用的DNA探针。

二、生物合成法（酶促合成法，适用于长链DNA探针）

    该方法利用DNA聚合酶的催化作用合成探针，适合制备长链DNA探针（＞100nt），主要包括缺口平移法和随机引物法两种。

 

1、缺口平移法

（1）制备带缺口的双链DNA

    以目标双链DNA为模板，加入DNA酶I（DNaseI），在温和条件下随机切割DNA链，形成多个单链缺口，暴露出3'-羟基末端。

 

（2）酶促合成与标记

    加入大肠杆菌DNA聚合酶I，该酶具有5'→3'外切酶活性和5'→3'聚合酶活性：
外切酶活性：从缺口的5'端逐步切除核苷酸；

    聚合酶活性：以互补链为模板，用含标记核苷酸（如³²P-dATP、荧光标记dUTP）的dNTP混合物，从3'-羟基末端合成新链，填补缺口。

    最终新合成的链带有标记物，成为DNA探针。

 

（3）终止反应与纯化

    加入EDTA螯合Mg²⁺（酶的必需辅因子）终止反应，通过酚-氯仿抽提、乙醇沉淀纯化探针。

 

2、随机引物法

（1）模板变性

    将双链DNA模板加热至95℃左右，变性为单链DNA。

 

（2）引物退火

    加入随机六核苷酸引物（由A、T、C、G随机组成的6nt短链），引物与单链模板的多个位点随机退火结合。

 

（3）酶促合成与标记

    加入Klenow片段（DNA聚合酶I的大片段，无5'→3'外切酶活性）和含标记dNTP的反应液，Klenow片段以退火的引物为起点，沿5'→3'方向合成互补链，新链中掺入标记核苷酸。

 

（4）纯化探针

    反应结束后，通过凝胶过滤或离心柱纯化，去除未掺入的dNTP和引物，得到高纯度的标记DNA探针。