EMSA凝胶电泳为什么必须使用非变性聚丙烯酰胺凝胶？

    EMSA（电泳迁移率变动分析，也称凝胶迁移实验）和常规琼脂糖凝胶电泳的本质区别在于实验目的、分离原理以及对样品的状态要求完全不同，具体可以从以下几个核心维度区分：

1、实验目的不同

    常规琼脂糖凝胶电泳的核心目的是分离不同分子量大小的核酸分子，比如质粒DNA的酶切鉴定、PCR产物的片段大小验证，仅关注核酸分子的分子量差异，不涉及核酸与其他分子的相互作用。

    EMSA的核心目的是检测核酸与蛋白质（或其他配体）之间的特异性结合，通过观察结合复合物的电泳迁移率变化，判断两者是否存在相互作用，以及结合的亲和力、特异性。

 

2、分离原理的侧重点不同

    常规琼脂糖凝胶电泳的分离依赖分子筛效应和电荷效应，琼脂糖凝胶的孔径较大，分子量越大的核酸分子迁移速度越慢，最终按分子量大小分带。

    EMSA的分离则依赖复合物的分子量和构象差异：游离的核酸分子分子量小、构象相对简单，电泳迁移速度快；当核酸与蛋白质结合形成复合物后，整体分子量显著增大，且构象变得复杂，在凝胶中的迁移阻力变大，迁移速度会远慢于游离核酸，从而形成位置不同的条带。

 

3、样品状态与电泳条件不同

    常规琼脂糖凝胶电泳对样品的状态无特殊要求，核酸可以是变性或非变性的，且电泳缓冲液多为常规的TAE或TBE缓冲液。

    EMSA要求样品全程保持天然构象，因为核酸与蛋白质的结合依赖两者的空间结构，一旦变性，结合作用会被破坏，实验就无法得到有效结果。

为什么EMSA必须使用非变性聚丙烯酰胺凝胶？

1、维持核酸-蛋白质复合物的稳定性

    非变性聚丙烯酰胺凝胶的电泳体系不含变性剂（如尿素、SDS），能够最大程度保留核酸和蛋白质的天然空间构象，确保两者形成的结合复合物在电泳过程中不会解离，从而可以通过迁移率差异区分游离核酸和复合物。

    若使用变性凝胶，蛋白质会变性失活，核酸也会被解链，两者的结合作用会完全被破坏，无法达到实验目的。

 

2、更高的分辨率

    聚丙烯酰胺凝胶的孔径远小于琼脂糖凝胶，且孔径大小可以通过调整丙烯酰胺和交联剂的比例灵活控制，能够精准区分分子量差异较小的分子或复合物。

    EMSA中游离核酸和核酸-蛋白质复合物的分子量差异往往没有大到可以用琼脂糖凝胶清晰分离的程度，聚丙烯酰胺凝胶的高分辨率可以让两者形成的条带界限分明，便于结果观察和分析。

 

3、避免非特异性吸附
相比于琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶对核酸和蛋白质的非特异性吸附更弱，能减少样品的损失，同时降低背景干扰，让条带更清晰，提高实验的准确性。